《Pathogens》：Optimization of Extraction Process and Antioxidant and Antibacterial Activities of Total Phenolics from Thalictrum baicalense Turcz
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贝加尔唐松草（Thalictrum baicalense Turcz）是一种传统药用植物。本研究采用响应面法（response surface methodology, RSM）优化贝加尔唐松草总酚的超声辅助溶剂提取工艺，并评价其抗氧化活性、抗菌活性及潜在抗菌
贝加尔唐松草（Thalictrum baicalense Turcz）是一种传统药用植物。本研究采用响应面法（response surface methodology, RSM）优化贝加尔唐松草总酚的超声辅助溶剂提取工艺，并评价其抗氧化活性、抗菌活性及潜在抗菌机制。确定的最佳提取条件为：超声功率120 W、料液比1:10（g:mL）、提取时间72 min、温度32 °C、乙醇浓度49%。在此条件下，总酚提取率可达15.116 mg没食子酸当量每克植物粉末（mg GAE/g）。抗氧化实验表明，在总酚浓度分别为33.33、20和3.85 μg GAE/mL时，对2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）、2,2′-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS+）和羟基自由基的清除率分别为83.41%、94.69%和78.95%，与维生素C相当。抗菌评价显示，总酚提取物对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有显著抑制活性，在570 μg GAE/mL浓度下抑制率达90.34%，而对革兰氏阴性菌大肠杆菌（Escherichia coli）的活性较弱。此外，结晶紫染色实验和扫描电镜观察提示，该提取物可减少生物被膜生物量并引起形态改变。另外，提取物处理显著降低了两种菌株的胞内ATP水平，提示其可能影响细菌能量代谢。然而，这些发现并未确立特异性的抗生物被膜机制，也未证实其与羧苄青霉素相当的疗效。综上，本研究为贝加尔唐松草天然生物活性成分在抗氧化和抗菌制剂领域的潜在应用提供了初步科学依据。
贝加尔唐松草总酚提取工艺优化及其抗氧化与抗菌活性研究解读
一、研究背景与意义
贝加尔唐松草（Thalictrum baicalense Turcz）隶属毛茛科唐松草属，该属全球约200种，我国分布99种及22变种，其中43种作为民间药用植物。唐松草属植物广泛分布于亚洲、非洲、欧洲、南美洲和北美洲，在我国主要见于甘肃、四川、云南、西藏、吉林、河南、青海、宁夏和陕西等地，其中四川、云南、河南和甘肃表现出显著的区域物种多样性。该属植物具有抗菌、抗氧化、抗病毒和抗肿瘤等多种药理活性，民间常用于治疗高血压和肠炎，并作为利尿剂和健胃剂使用。已有研究表明，同属其他物种如多小叶唐松草和臭唐松草具有显著的抗氧化和抗菌活性，且与其总酚、黄酮和生物碱等生物活性成分含量密切相关。然而，目前对贝加尔唐松草的研究主要集中于生物碱、真菌共生和叶绿体基因组，其总酚提取方法及抗氧化和抗菌活性尚未被系统探索。
植物源酚类化合物，包括黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、黄烷酮类、查尔酮类和黄烷-3-醇类，具有广谱抗菌潜力，而日益严峻的抗生素耐药危机使从天然产物中发掘新型抗菌剂成为研究重点。贝加尔唐松草作为一种尚未被系统研究的药用植物，可能含有具有重要开发价值的酚类成分。因此，从中筛选高效安全的抗菌活性成分，不仅可为应对抗生素耐药提供新策略，也可为开发天然抗菌替代品奠定基础。为实现该目标，首先需要建立高效的酚类提取方法。传统提取技术如浸渍法、回流提取法、索氏提取法和煎煮法耗时较长、溶剂用量大，且长时间加热易导致热敏成分降解。相比之下，超声辅助溶剂提取（UASE）利用空化效应破坏植物细胞壁，可有效缩短提取时间并提高提取率。同时，响应面法（RSM）作为现代实验设计方法，可通过构建数学模型优化提取参数，在提高提取效率的同时降低实验成本和时间消耗。
尽管RSM已被广泛用于优化多种植物材料的酚类提取，但迄今尚无研究将其应用于优化贝加尔唐松草总酚的UASE条件，且该植物总酚成分的抗氧化和抗菌潜力尚未被系统评估。为填补这一空白，本研究采用RSM优化UASE参数，具体包括超声时间、超声温度和乙醇浓度，以提高贝加尔唐松草总酚的提取效率。此外，本研究首次系统评估了乙醇提取物的抗氧化和抗菌活性，并初步探索了其抗菌机制，预期为这种药用植物的功能开发和利用提供理论基础。
二、主要关键技术方法
研究人员采用超声辅助溶剂提取法提取贝加尔唐松草总酚，并使用响应面法中的Box-Behnken设计（BBD）优化提取工艺参数。提取物化学成分通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行分析。总酚含量采用福林-酚比色法测定。抗氧化活性通过DPPH自由基清除、ABTS+自由基清除和羟基自由基清除三种实验评估。抗菌活性通过生长抑制实验和生长动力学实验测定，并通过扫描电子显微镜（SEM）观察细菌形态变化，采用结晶紫染色法定量评估生物被膜形成量，使用ATP检测试剂盒测定细菌胞内ATP含量。植物材料采自中国四川省成都市，凭证标本（2022-dp-5）由昆明GenPHYTech有限公司张军鉴定，保存于中国遵义医科大学。
三、研究结果
3.1 提取物化学指纹图谱（LC-MS分析）
LC-MS分析显示，总离子流色谱图（TIC）和PDA色谱图（254 nm）呈现多个色谱峰，表明提取物为复杂混合物。主要PDA峰保留时间分别为0.44、2.87、3.25和3.98 min，相对峰面积分别为45.61%、18.53%、27.98%和1.93%。正离子模式下，3.322 min处的峰显示主要碎片离子为m/z 335.96，对应3.25 min处的PDA主峰；负离子模式下，2.901 min处的峰显示特征碎片离子为m/z 381.87，对应2.87 min处的PDA峰。这些数据证实了提取物的化学复杂性，但未使用标准品或经验证的谱库匹配，无法对单个酚类化合物进行确定性鉴定。
3.2 总酚含量测定
以没食子酸为参照标准在765 nm处构建标准曲线，回归方程为y = 0.03675x + 0.007307，R2 = 0.9997，表明没食子酸浓度与吸光度之间呈强线性关系，可用于定量贝加尔唐松草总酚浓度。
3.3 单因素实验
提取时间从30 min延长至70 min时，总酚提取率逐渐升高，在70 min时达到最大值14.302 mg GAE/g，更长时间可能导致酚类在持续超声过程中降解或氧化。提取温度显著影响总酚提取率，35 °C时获得最大提取率，适度升温可增强溶剂与酚类分子的接触频率，但过高温度可能加剧溶剂挥发并导致酚类热降解。乙醇浓度为50%时提取率最高，此浓度下醇水溶剂的极性有利于酚类化合物的溶解，但乙醇浓度过高会降低溶剂极性，限制酚类溶解度。
3.4 响应面优化
基于单因素实验结果，采用三因素三水平Box-Behnken设计，以提取温度（30–40 °C）、提取时间（50–90 min）和乙醇浓度（40–60%）为自变量，总酚提取率为响应值。回归分析得到二次多项式方程，模型F值为59.15，p < 0.0001，表明模型高度显著。失拟项检验p > 0.05，确认模型拟合良好。各因素对总酚提取率的影响顺序为：提取温度 > 乙醇浓度 > 提取时间。预测R2（0.8295）与校正R2（0.9703）之差小于0.2，表明预测值与实际值一致性良好。
3.5 响应面分析
三维响应面图和等高线图直观展示了三个变量对总酚提取率的交互影响。在固定乙醇浓度下，提取温度从30 °C升至32.29 °C、提取时间从50 min延长至72.11 min时，总酚提取率增加。在固定提取时间下，乙醇浓度从40%升至48.61%、温度从30 °C升至32.29 °C时提取率提高。在固定提取温度下，乙醇浓度在40–48.61%且提取时间在50–72.11 min范围内时总酚提取率达到最大值。
3.6 模型验证
模型预测的最佳提取条件为72.113 min、32.290 °C和48.614%乙醇，预测总酚提取率为15.005 mg GAE/g。为便于实际操作，调整为72 min、32 °C和49%乙醇。在此条件下进行三次独立验证实验，平均总酚提取率为15.116 mg GAE/g（RSD = 0.13%），比预测值高0.111 mg/g（0.74%）。95%预测区间为14.53–15.48 mg GAE/g，观测均值落在该区间内，确认了模型在研究设计空间内的可靠性。
3.7 抗氧化活性
DPPH自由基清除活性在6.67–33.33 μg GAE/mL浓度范围内随浓度增加而升高，在33.33 μg GAE/mL时达到最大值（83.41 ± 0.37）%，略低于同浓度下维生素C的（89.66 ± 0.38）%。ABTS+自由基清除活性在浓度升至8 μg GAE/mL时达到峰值94.70%，略高于维生素C的93.10%；在12–20 μg GAE/mL范围内清除活性稳定在94.51%–94.69%之间，与维生素C（94.97–95.01%）相当。羟基自由基清除活性在0.77–3.85 μg GAE/mL浓度范围内为73.43%–78.95%，与维生素C（77.19–86.76%）相近，表明具有中等程度的羟基自由基清除能力。
3.8 抗菌活性
总酚提取物对大肠杆菌的抑制率随浓度升高至142.5 μg GAE/mL后不再显著增加，生长曲线分析确认浓度≥142.5 μg GAE/mL时大肠杆菌生长受到明显抑制。对金黄色葡萄球菌的抑制活性更为显著，在570 μg GAE/mL时抑制率达（90.34 ± 0.1）%，与同浓度阳性对照羧苄青霉素无显著差异，生长曲线显示该浓度下OD600值接近0.1。扫描电镜观察显示，未经处理的菌体形态正常，而经300 μg GAE/mL提取物处理6 h后，大肠杆菌出现明显形态损伤和结构崩解，金黄色葡萄球菌出现聚集和肿胀。结晶紫染色定量分析显示，总酚提取物在540 μg GAE/mL时显著抑制大肠杆菌生物被膜形成，对金黄色葡萄球菌生物被膜在135和270 μg GAE/mL时显著减少，在540 μg GAE/mL时高度显著抑制。胞内ATP测定显示，经300 μg GAE/mL提取物处理1 h和3 h后，两种菌株的胞内ATP浓度均显著低于PBS对照组。
四、讨论与结论
本研究通过LC-MS分析确认提取物化学组成复杂，但单个酚类化合物的确定性鉴定仍需标准品或经验证的谱库匹配。采用UASE结合RSM优化了贝加尔唐松草总酚提取工艺，确定最佳提取条件为提取时间72 min、提取温度32 °C、乙醇浓度49%（v/v），该条件下总酚提取率达15.116 mg GAE/g，与模型预测值吻合良好，证实了提取工艺的可靠性和有效性。抗氧化活性评价表明总酚提取物对DPPH、ABTS+和·OH具有强清除活性，与同浓度维生素C相当。抗菌活性测定显示总酚提取物在570 μg GAE/mL浓度下对金黄色葡萄球菌抑制率达（90.34 ± 0.1）%，虽与阳性对照无显著差异，但尚不能据此确立等效疗效，对大肠杆菌活性较弱。机制研究表明其抗菌作用可能涉及降低胞内ATP水平和减少生物被膜生物量，但尚不能确立特异性抗生物被膜机制。综上，贝加尔唐松草总酚提取物在体外表现出良好的抗氧化活性和显著的抗金黄色葡萄球菌活性，提示其作为天然抗氧化剂和抗菌剂的潜力。实际应用于食品和医药领域仍需体内研究、广谱测试和安全性评价的进一步验证，本研究为其后续开发提供了初步实验基础。
