《Pathogens》：Pseudovirus Nanoparticles Displaying the Receptor-Binding Glycoprotein of Marburg Virus as Potential Vaccine Candidates
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背景：针对致死性马尔堡病毒（Marburg virus, MARV）的获批疫苗仍缺乏，这需要开发新型有效疫苗策略。方法：研究人员在此报告开发了三种假病毒纳米颗粒（pseudovirus nanoparticles, PVNPs），每种展示不同长度的MARV中和
背景：针对致死性马尔堡病毒（Marburg virus, MARV）的获批疫苗仍缺乏，这需要开发新型有效疫苗策略。方法：研究人员在此报告开发了三种假病毒纳米颗粒（pseudovirus nanoparticles, PVNPs），每种展示不同长度的MARV中和糖蛋白（glycoprotein, GP）片段，作为MARV疫苗候选。这些PVNPs命名为S-GP278、S-GP377和S-GP486，利用研究人员专有的诺如病毒壳纳米颗粒（norovirus shell nanoparticle, SNP）平台生成。对PVNPs的生产、自组装、形态、结构特性和免疫原性进行了评估。结果：数据表明，三种重组S-GP蛋白S-GP278、S-GP377和S-GP486可利用大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）表达系统低成本生产。纯化的重组S-GP蛋白高效自组装成PVNPs。S-GP1 PVNPs的结构建模突出其关键结构特征，由二十面体内部壳和展示于表面的多个三聚体GP结构组成。用S-GP PVNPs免疫小鼠诱导高滴度GP特异性抗体，包括免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白A（IgA）。结论：总体而言，这些数据支持S-GP PVNPs可能作为值得进一步开发的潜在MARV疫苗候选。
马尔堡病毒（Marburg virus, MARV）与埃博拉病毒（Ebolaviruses, EBOVs）同属丝状病毒科（Filoviridae），但分属Marburgvirus和Ebolavirus两个属。MARV引起马尔堡病毒病（Marburg virus disease, MVD），即马尔堡出血热，临床表现包括发热、严重头痛、肌肉疼痛、呕吐、腹泻以及内出血或外出血；总体病死率约50%，既往暴发范围为24%至88%。埃及果蝠（Rousettus aegyptiacus）被认为是MARV主要自然储存宿主，动物溢出传播至人后可发生人传人并导致致死性MVD暴发。2024年10月卢旺达发生最近一次MVD暴发，至少64人感染、15人死亡。目前尚无获批的MVD疫苗或抗病毒治疗，支持性治疗如补液和对症处理可提高生存机会。MARV为包膜RNA病毒，呈多形性，直径约80 nm，长度可变；其核心为螺旋核衣壳，单股负义RNA基因组约19.1 kb，含七个基因编码NP、VP35、VP40、GP、VP30、VP24和RNA依赖的RNA聚合酶（L）。表面刺突为三聚体GP复合物，由三个酰化且高度糖基化的GP分子组成；GP属于I型跨膜蛋白，经furin切割生成GP1和GP2，GP1含高度糖基化mucin样结构域并负责受体结合，GP2含膜锚定区和融合环并介导膜融合。GP在病毒进入中关键，是疫苗开发的优良靶点，目标为诱导中和抗体阻断GP1与宿主受体相互作用并抑制GP2融合活性。现有无商业MARV疫苗，世界卫生组织（WHO）优先支持四种基于病毒载体的GP疫苗候选进入人体试验评估；最先进者为Sabin Vaccine Institute开发的单价黑猩猩腺病毒载体MARV疫苗，已在乌干达和肯尼亚进行II期临床试验（ClinicalTrials.gov ID: NCT05817422），此前I期显示安全并诱导快速强免疫应答；第二个优先候选为Oxford University的ChAdOx1 Marburg疫苗，2024年初进行I期试验；另两个为基于水疱性口炎病毒（VSV）载体的rVSV?G-MARV-GP（International AIDS Vaccine Initiative, IAVI开发）和rVSV?G-MARV (Angola) GP（Public Health Vaccines LLC开发），均处于临床前开发。研究人员先前证明，修饰的诺如病毒（norovirus, NoV）壳（shell, S）结构域可自组装成S纳米颗粒（SNPs），类似NoV内壳，表面具有柔性C端铰链；将其他病原体的中和抗原融合至S结构域铰链可自组装成PVNPs并在表面展示抗原，该结构可显著增强展示抗原的免疫原性。基于此SNP平台，研究人员在本研究中采用新的MARV疫苗开发策略，将不同长度MARV GP融合至NoV S结构域，用重组蛋白表达系统生产融合蛋白；所得S-GP融合蛋白自组装成PVNPs，并诱导强GP特异性IgG和IgA抗体应答，因此S-GP PVNPs显示作为MARV疫苗候选的潜力。
关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员选择MARV Angola株GP抗原的三个片段，即GP278、GP377和GP486，将其与NoV S结构域融合，在大肠杆菌（E. coli）表达系统中重组表达，经变性条件纯化和复折叠获得S-GP融合蛋白；采用SDS-PAGE、凝胶过滤色谱、负染透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、酶免疫分析（EIA）与酶联免疫吸附测定（ELISA）评估蛋白纯度、自组装、形态、粒径和抗体滴度；使用UCSF ChimeraX软件，以S-HA1 H7 PVNP冷冻电镜（cryoEM）结构为模板进行结构建模；免疫实验使用购自Jackson Laboratory的BALB/c小鼠，在Cincinnati Children’s Hospital Medical Center饲养，经肌内免疫后采集血清。
3.1 三种S-GP融合蛋白的生成：通过E. coli表达系统生成三种基于NoV S结构域的融合蛋白：S-GP278含NoV S结构域和缺失大部分mucin样结构域的GP1；S-GP377含S结构域、GP1前半部分和GP2；S-GP486含S结构域、缺失大部分mucin样结构域的GP1和GP2。经His标签钴树脂在变性条件下纯化，梯度透析去除变性剂，氧化还原复折叠后获得可溶性蛋白，产量20–30 mg/L细菌培养。SDS-PAGE显示各蛋白单一主带，纯度>90%；表观分子量约60、75和85 kDa，大于计算值约55、66和77 kDa。EIA显示三种S-GP蛋白及S结构域阳性对照均被含S结构域NoV病毒样颗粒（VLPs）免疫的豚鼠高免疫血清强识别，GST无信号，证实S结构域身份。
3.2 S-GP蛋白自组装成PVNPs：凝胶过滤显示三种S-GP蛋白在或接近void volume处洗脱为两个部分重叠峰P1和P2，类似S-HA1 PVNPs，提示自组装成高分子量颗粒；单体或二聚体峰较少。约20 mL后出现的峰在SDS-PAGE无蛋白条带，且复折叠缓冲液单独显示相同峰，提示来源于缓冲液，可能为氧化型谷胱甘肽，在A
280有吸收。
3.3 S-GP PVNPs的形态：负染TEM显示三种S-GP蛋白均形成典型PVNP形态，颗粒大小不一；主要群体直径25至45 nm，S-GP486 PVNPs整体最大，与其蛋白尺寸较大一致。
3.4 S-GP PVNPs的尺寸分布：DLS显示三种蛋白均形成不同大小PVNPs，峰分布位于TEM范围内，粒径顺序S-GP486 > S-GP377 > S-GP278；S-GP278多数23–38 nm，S-GP377多数24–42 nm，S-GP486多数29–48 nm，与其蛋白相对大小一致。该尺寸变化可能与重组NoV VP1在体外形成T = 1、T = 3和T = 4 VLPs倾向有关；与已知NoV VLPs比较，提示三种S-GP蛋白形成的PVNPs涵盖三种对称类型，分别对应60、180和240个融合蛋白单元组装。
3.5 S-GP1 PVNPs的结构建模：研究人员先前用cryoEM解析H7N9禽流感S-HA1 PVNP三维结构，其呈T = 1二十面体对称，由60个S-HA1蛋白组成，60个HA1结构域在表面组织为20个三聚体。因MARV GP也形成三聚体且GP1三聚体晶体结构已知（PDB code: 5UQY），研究人员以S-HA1 PVNP的cryoEM结构为模板，在UCSF ChimeraX中构建T = 1、T = 3和T = 4二十面体对称的S-GP1结构模型。模型显示不同对称对应不同大小颗粒，与TEM和DLS观察一致；GP1在S结构域纳米颗粒表面形成20（T = 1）、60（T = 3）和80（T = 4）个三聚体突出。原文指出这些为计算预测模型，尚未实验确定或验证。
3.6 S-GP PVNPs的抗体反应：研究人员在小鼠中评估三种S-GP PVNPs免疫原性，以SNP为平台对照、PBS为阴性对照。小鼠经两次或三次肌内免疫后，用商业重组GP蛋白作为捕获抗原，通过ELISA检测GP特异性IgG和IgA滴度。两次免疫后GP特异性IgG升至1:1200至1:2000；三次免疫后IgG升高9至30倍，达1:16,800至1:38,400；GP特异性血清IgA较低，为1:850至1:1300。展示最长GP片段（GP486）的PVNP诱导最强GP特异性IgG和IgA应答，被确定为领先疫苗候选。以重组S-GP486 PVNP作捕获抗原时，IgG滴度在两次免疫后为1:10,800至1:110,933，三次后为1:345,600至1:742,400，比两次免疫升高6.7至50倍；IgA滴度为1:1200至1:6600，比用商业GP蛋白检测高1.4至7.7倍。以SNP作捕获抗原时，三次免疫后SNP特异性IgG滴度为1:20,000至1:94,400，IgA为1:650至1:1250。两次免疫后的抗体应答仅有限评估，因为活鼠尾静脉采血体积有限。
讨论部分总结：讨论指出，基于专有SNP平台开发三种展示不同长度MARV GP片段的PVNPs。初始表征证明：三种S-GP融合蛋白可利用细菌表达低成本生产；纯化蛋白高效自组装成PVNPs；结构建模阐明典型PVNP关键结构特征；免疫诱导小鼠强血清抗体应答。总体支持S-GP PVNPs作为MARV疫苗候选并值得进一步开发评估。GP486是SNP平台迄今展示的最大抗原，含N端GGGG连接子和C端His标签后总长度接近500个氨基酸，且仍能高效形成PVNPs，显示NoV SNP平台的大载货能力。结构建模提示S-GP486 PVNP保留典型PVNP结构，表面展示多个抗原，显示平台通用性。ELISA使用不同捕获抗原时抗体滴度差异明显：以S-GP486 PVNP捕获测得滴度高于以杆状病毒/昆虫细胞表达的GP蛋白捕获，可能与PVNP表面多价（60、180或240价）重复抗原展示有关；后者滴度较低可能反映两种表达系统翻译后修饰差异。天然GP高度糖基化，杆状病毒/昆虫细胞系统至少部分模拟天然糖基化，而E. coli缺乏糖基化机制；因此细菌表达的S-GP PVNPs诱导抗体可能更有效识别同样无糖基化的S-GP486 PVNP，而对昆虫细胞表达GP识别降低。未来S-GP PVNP生产可能受益于真核表达系统，如哺乳动物、昆虫或酵母细胞，以保留天然GP糖基化并诱导更接近天然病毒GP构象的抗体。除糖基化外，二硫键形成也重要；MARV GP含分子内和分子间二硫键，对结构完整性和功能重要。细菌系统可支持部分二硫键形成，但可能不能忠实再现真核细胞中完整天然二硫键模式；当前未确定细菌表达MARV GP是否保留天然二硫键构象，故真核表达系统可能更优。血清IgA一般被视为疫苗或感染诱导免疫标志，其保护作用可能与IgG不同；MARV特异性血清IgA研究不如某些呼吸道或肠道病毒充分。研究人员假设MARV GP特异性IgA可结合病毒糖蛋白并可能干扰病毒-宿主细胞相互作用，从而降低感染，因此评估GP特异性IgA可更全面理解免疫应答。该研究为基于PVNP平台的新型MARV疫苗早期开发，主要集中于S-GP PVNPs生成和表征，无法与当前现场领先候选直接比较。PVNP候选潜在优势包括：每个PVNP表面展示60至240拷贝GP抗原可能增强免疫原性；重组S-GP PVNPs可用可扩展制造工艺生产，可能降低成本；非复制性PVNP疫苗消除活病毒载体相关安全顾虑。MARV系统发育分两谱系：经典Lake Victoria MARV谱系（含Angola、Musoke、Popp和Ci67株）和Ravn virus（RAVV）谱系，二者总体蛋白序列差异约22%；Lake Victoria MARV谱系内GP高度保守，氨基酸同一性超过90%，支持跨株中和和保护潜力。Angola株GP因Angola暴发为迄今最大最严重MARV暴发而广泛用于疫苗开发，并成为许多临床前效力研究标准攻击株；但针对遗传不同的RAVV谱系交叉保护尚待实验评估。选择GP278、GP377和GP486三种片段旨在探索最大化GP抗原长度与维持S-GP PVNPs自组装能力之间的平衡，以纳入尽可能多功能GP结构域；结果三种PVNPs均成功生成，展示最长GP片段GP486的PVNP诱导最强血清IgG和IgA应答，被确定领先候选。MARV为风险组4（Risk Group 4, RG4）病原体，属生物安全4级（Biosafety Level 4, BSL-4）病原，需最高级别生物 containment，因此研究人员实验室无法评估S-GP PVNP候选对活MARV攻击的保护效力，这是研究限制；未来将与具备MARV假病毒中和试验及MARV攻击研究能力的专家合作，评估中和活性和保护效力；此外未进行细胞因子谱分析评估纳米颗粒治疗潜在免疫影响，也是限制，将在未来研究解决。另一方面，近期研究显示SNP诱导抗体能在人肠道肠类器官系统中中和人诺如病毒复制，提示NoV S结构域为中和抗原；本研究中S-GP PVNPs也诱导SNP特异性IgG和IgA应答，提示S-GP PVNPs可能作为抗MARV和诺如病毒的双价疫苗，该假设值得进一步研究。研究结论翻译：总体而言，这些数据支持S-GP PVNPs可作为值得进一步开发的潜在MARV疫苗候选这一观点。
