共培养增强两株昆虫肠道来源芽孢杆菌的胞外内切葡聚糖酶活性

《Fermentation》：Co-Cultivation Enhances Extracellular Endoglucanase Activity in Two Insect-Gut-Derived Bacillus Isolates

　　

昆虫肠道栖息着具有碳水化合物活性酶的微生物，但其作为产酶菌株的潜力以及共培养的益处仍未得到充分表征。本研究从9种昆虫肠道来源的180株细菌分离物中筛选具有羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose, CMC）水解活性的菌株。基于形态学特征和16S rRNA基因分析，将两株非溶血性分离物H11和Q5-3归属于芽孢杆菌属（Bacillus）。其初始胞外内切葡聚糖酶活性分别为156.67 ± 4.17 U/mL和190.36 ± 4.29 U/mL，经正交阵列优化后分别提高至228.01 ± 2.73 U/mL和283.28 ± 2.06 U/mL。中心复合设计（central composite design, CCD）预测在总接种量约为16%（v/v）且Q5-3/H11接种量比为2.08时，最大体积活性为340.81 U/mL；独立验证获得339.17 ± 3.97 U/mL。在相同总接种比例下评估的额外H11和Q5-3单培养对照显示，其平均体积活性低于已验证的共培养。PCR筛选在两个菌株中均产生了5个推定的内切葡聚糖酶相关靶标的预期大小扩增子。这些结果表明，H11和Q5-3是有前景的昆虫肠道来源的胞外内切葡聚糖酶生产候选菌株，且共培养可在无需基因修饰的情况下增强CMC上的体积酶活性。本研究在受控的可溶性CMC模型系统中建立了候选菌株和经过验证的共培养工艺，为后续评估菌株互作及其在不溶性纤维素和代表性木质纤维素底物上的性能提供了工艺开发基础。

植物食性昆虫因持续取食富含纤维素的植物组织，其肠道形成了筛选纤维素降解微生物的生态位。已有研究从多种昆虫肠道中分离到具有纤维素酶活性的细菌，但多数工作集中在单一菌株，共培养对胞外内切葡聚糖酶产量的影响仍未获得充分表征。基于此，研究人员从辽宁省沈阳市多个地点采集的9种野生昆虫肠道中分离的180株细菌作为样本队列，开展系统筛选与工艺优化，旨在明确共培养能否在无需基因改造的情况下提高体积内切葡聚糖酶活性。

该研究首先通过CMC琼脂平板和刚果红染色初筛，获得86株具有CMC水解活性的分离物，其中19株水解圈直径/菌落直径比（D/d）>3.0；DNS法定量显示Q5-3、H11和L1的胞外内切葡聚糖酶（endoglucanase）活性最高。溶血试验表明H11和Q5-3呈非溶血表型，而L1呈β-溶血，故后续选用H11和Q5-3。形态学和16S rRNA基因系统发育分析将两株菌归属于芽孢杆菌属（Bacillus），但不足以确定种水平，因此保守命名为Bacillus分离物H11和Q5-3。单因素试验显示两株菌在测试条件下均表现出以CMC水解为主的内切葡聚糖酶活性，外切葡聚糖酶（exoglucanase）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）活性较低。采用L₉(3³)正交阵列优化接种量、培养时间和初始pH，极差分析表明初始pH对体积酶活贡献最大，H11与Q5-3共同的最优条件为8%接种量、初始pH 5.0和24 h，优化后酶活分别达228.01 ± 2.73和283.28 ± 2.06 U/mL，较优化前增加46%和49%。进一步利用中心复合设计（central composite design, CCD）与响应面法，以总接种量和Q5-3/H11接种比（v/v）为变量，模型预测最大体积酶活为340.81 U/mL（总接种量约16%，接种比2.08），独立验证为339.17 ± 3.97 U/mL。在相同约16%总接种量下，H11和Q5-3单培养的对应酶活分别为96.69 ± 1.89和127.47 ± 7.24 U/mL，共培养分别高3.51倍和2.66倍，表明共培养的增强效应不能仅由总接种量解释。PCR初筛中，针对egls、eg20SJ、Nqm、Cel5L和eglsG的5对引物在两株菌中均扩增出预期大小片段，但未测序验证，仅视为候选靶标。

在讨论中，研究人员指出，从植食性昆虫肠道获得高活性Bacillus分离物，丰富了昆虫肠道作为纤维素酶菌种资源库的证据。两株菌表现为内切葡聚糖酶主导的胞外酶活谱，但可溶性CMC测定结果不能直接代表对不溶性纤维素或木质纤维素底物的水解能力。两株菌在温度暴露恢复和初始pH响应上有差异，却共享同一最佳单培养条件，这为后续共培养建模提供了统一基础。CCD模型表明，体积酶活同时受总接种量和初始菌株比例影响，存在明确的最优配比，说明共培养效应并非简单混合所致。增强机制可能包括酶互补、交叉喂养、环境修饰或群体感应，但尚需菌株特异性生物量、代谢物、分泌蛋白组和转录组研究证实。PCR扩增谱在两株菌中相似，但表型差异提示基因调控和分泌可能起重要作用。总体而言，该研究通过菌株筛选、单培养优化、共培养建模、实验验证和匹配接种量对照，建立了受控可溶性CMC模型系统中的胞外内切葡聚糖酶生产工艺开发框架；H11和Q5-3是候选生产菌株，验证的共培养条件为后续在不溶性纤维素和代表性木质纤维素底物上评估菌株互作与性能提供了基础。