炎症响应性糖萼模拟水凝胶功能化生物瓣膜：用于黄芩素递送、抗血栓及免疫调节

《Acta Biomaterialia》：Inflammation-Responsive Baicalin-Delivering Glycocalyx-Mimetic Hydrogel-Functionalized Bioprosthetic Valve for Antithrombosis and Immunomodulation

　　

摘要

瓣膜性心脏病（VHD）是一种常见的与年龄相关的高死亡率疾病，主要治疗方法是人工瓣膜置换。由于血流动力学性能优越且适用于经导管递送，生物瓣膜（BHVs）在临床实践中越来越受青睐。然而，当前的戊二醛交联工艺未能赋予瓣膜抗凝血、抗氧化和免疫调节特性，使得生物瓣膜易发生血栓形成、氧化应激、炎症和钙化，这些因素共同加速了瓣膜结构劣化（SVD），缩短了其使用寿命。在此，研究者利用贻贝启发的邻苯二酚化学，构建了一种炎症响应性、糖萼模拟水凝胶功能化的生物瓣膜（BA@ALG-PP），该体系将类血管糖萼层与负载黄芩苷、活性氧（ROS）响应性纳米颗粒整合为一体。通过在异源胶原基质上引入生物相容的糖萼模拟层，BA@ALG-PP表现出改善的抗凝血和内皮化性能，并通过兔血管内植入实验得到了体内验证。此外，ROS响应性纳米颗粒有效清除氧化物种，并在刺激下实现抗炎分子黄芩苷的按需释放，从而调节局部炎症反应。巨噬细胞转录分析表明，BA@ALG-PP调节了关键炎症相关基因（Tnfaip3、Hmox1、Stat1和Saa3）的表达，并抑制了促炎信号通路，包括NF-κB、MAPK和JAK-STAT通路。此外，在大鼠皮下植入实验中，BA@ALG-PP表现出改善的抗钙化特性。综上所述，这一多功能策略赋予生物瓣膜协同的抗凝血、抗氧化、免疫调节和抗钙化能力，为改善生物瓣膜性能提供了一种潜在策略，值得进一步在大动物模型中进行研究，并可能减轻导致SVD的因素。

意义声明

戊二醛交联的生物瓣膜（BHVs）因血栓形成、氧化应激和慢性炎症导致瓣膜结构劣化，而现有的表面工程策略仍存在功能局限性。本研究报道了一种通过贻贝启发的邻苯二酚化学制备的炎症响应性糖萼模拟水凝胶功能化生物瓣膜（BA@ALG-PP）。该体系将非戊二醛交联、ROS响应性黄芩苷释放和内皮糖萼模拟整合为一个多功能平台。BA@ALG-PP展现出增强的抗凝血性能、加速的内皮化、有效的ROS清除能力，以及通过NF-κB、MAPK和JAK-STAT通路调节实现巨噬细胞从M1向M2表型极化。此外，它在体内显著减少了钙化。本工作为生物瓣膜的交联和表面工程建立了一种全面的策略，提供了一种可临床转化的方法来延长生物瓣膜耐久性并改善患者预后。

引言

瓣膜性心脏病（VHD）因其高死亡率和与年龄相关的患病率，需要通过人工心脏瓣膜置换作为确定性治疗和金标准干预手段[[1], [2], [3]]。人工心脏瓣膜目前分为两大类。机械瓣膜以耐久性著称，但受限于次优的血流动力学性能以及需要开胸植入[4]。生物瓣膜（BHVs）具有有利的血流动力学性能，并允许低风险的经导管递送，使得生物瓣膜成为老年合并症患者群体的优选方案[5,6]。随着经导管心脏瓣膜置换的应用与发展，生物瓣膜的操作安全性和长期治疗效果得到了显著提升[7,8]。随着人口老龄化加剧，VHD患病率日益增长，促使生物瓣膜植入在临床上得到广泛采用[9]。

目前，生物瓣膜主要由戊二醛交联的猪或牛心包组织制备而成。虽然戊二醛交联增强了心包的生物力学稳定性并降低了免疫原性，但残余醛基不可避免地引入了促进钙化和免疫反应的因素[10,11]。关键在于，戊二醛交联未能赋予生物瓣膜抗凝血、抗氧化和免疫调节特性。植入后的挑战，包括生物相容性不足、钙化、血栓形成、免疫炎症级联反应和氧化应激，共同加速了瓣膜结构劣化（SVD）并缩短了生物瓣膜的使用寿命[[12], [13], [14]]。细胞毒性阻碍内皮化，同时加剧生物瓣膜的矿化。内皮层的缺失导致生物瓣膜的胶原基质暴露于血液成分，触发生物瓣膜的血栓形成[15,16]。此外，生物瓣膜的异源基质引发免疫识别和反应，导致免疫细胞募集和浸润以及炎症反应。持续性炎症产生基质金属蛋白酶（MMPs）和活性氧（ROS），协同对生物瓣膜基质造成不可逆损伤，诱导生物瓣膜的钙化退变和功能障碍[17,18]。

同时解决戊二醛交联的局限性并增强生物瓣膜的抗凝血、内皮化、免疫调节和抗氧化能力，可能显著减轻SVD[19]。由于生物瓣膜-血液界面相互作用介导血栓和免疫反应，构建非戊二醛交联的生物瓣膜并结合表面多功能工程，可有效增强其抗凝血特性和免疫调节能力[[20], [21], [22]]。鉴于邻苯二酚具有高反应活性和优异的抗氧化特性，贻贝粘附蛋白启发的邻苯二酚化学已被广泛应用于功能化水凝胶的构建，为生物瓣膜的交联和功能化提供了一种潜在方法[23,24]。

内皮糖萼由阴离子多糖组成，是血管内壁的凝胶层，可抵抗血液成分的非特异性黏附[25]。水凝胶由于其生物相容性和可调性质，在心血管生物材料的表面工程中得到了广泛应用[26]。在生物瓣膜上构建糖萼模拟水凝胶有望显著增强其抗凝血特性。先前的研究使用肝素、透明质酸或硫酸软骨素在心血管材料上构建类糖萼层。虽然这些方法模拟了天然糖萼的组成，但具有固有的药理活性，且易受酶降解。海藻酸钠作为一种生物相容的阴离子多糖，已被广泛应用于心血管植入物的水凝胶体系，是糖萼模拟水凝胶的有前景的候选基质[27]。

由于糖萼模拟水凝胶仅作为被动生物相容性屏障，无法实现免疫调节功能，将药物与医疗器械整合提供了一种有前景的解决方案[[28], [29], [30]]。邻苯二酚-胺化学能够实现负载药物纳米颗粒的共价固定，赋予被动氨基糖苷类涂层无法提供的主动免疫调节功能。黄芩苷（BA）是从黄芩中提取的天然黄酮类化合物，具有优异的抗氧化、抗炎和免疫调节效果[[31], [32], [33]]。BA可抑制NF-κB通路的激活，下调炎症区域相关的细胞因子和趋化因子，从而改善抗氧化状态、减轻氧化应激和缓解炎症。然而，其低水溶性影响了其生物利用度，需要进一步研究优化其应用[[34], [35], [36]]。开发炎症响应性载药水凝胶体系与原位整合的生物瓣膜，对于在生物瓣膜上实现按需药物释放和免疫炎症反应的精确调节具有重要意义[37,38]。由于炎症微环境中升高的ROS水平会对生物瓣膜造成氧化损伤，ROS响应性糖萼模拟水凝胶有望协同清除ROS并调节免疫炎症反应。

受上述知识和见解的启发，我们基于贻贝粘附蛋白启发的邻苯二酚化学开发了一种炎症响应性糖萼模拟水凝胶功能化生物瓣膜（BA@ALG-PP）（方案1）。通过酰胺缩合反应将咖啡酸接枝到猪心包上以引入邻苯二酚基团，随后与多巴胺修饰的海藻酸钠进行原位氧化偶联反应，同时实现交联和生物瓣膜表面糖萼模拟水凝胶的构建。此外，通过苯硼酸取代聚赖氨酸与黄芩苷经苯硼酸酯键缩合，制备了富含氨基且具有ROS响应性的载药纳米颗粒[39]。基于贻贝粘附蛋白启发的邻苯二酚-胺反应[40]，将纳米颗粒共价引入糖萼模拟水凝胶，构建多功能化生物瓣膜。糖萼涂层提供抗凝血基础，而黄芩苷的释放应对炎症组分，从而共同应对单一功能方法无法同时解决的SVD两大驱动因素（血栓和炎症）。与戊二醛交联的猪心包相比，所制备的非戊二醛生物瓣膜（BA@ALG-PP）不仅表现出改善的抗凝血和内皮化性能，还有效清除了ROS并在响应性释放BA以调节免疫反应。此外，BA@ALG-PP在大鼠皮下模型中表现出相对较低的钙化程度。综上所述，所提出的策略协同增强了生物瓣膜的抗凝血、抗氧化、免疫调节和抗钙化属性，降低了SVD风险，并为生物瓣膜的交联和表面工程提供了有价值的见解。

材料

新鲜猪心包由Venus Medtech（中国杭州）提供。戊二醛（CAT: G0068）购自TCI（中国上海）。咖啡酸（CA，CAT: 48857C）、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物（DMTMM，CAT: 54211D）和多巴胺盐酸盐（CAT: 71406B）购自阿达玛斯试剂（中国上海）。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC，CAT: B010017）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，CAT: A01079249）、十二烷基硫酸钠……

BA@EPBA的制备与表征

为了合成负载黄芩苷的纳米颗粒，我们制备了EPL-PBA并将其与黄芩苷自组装形成纳米颗粒（图1a）。按照之前描述的方法，通过使用氰基硼氢化钠还原Schiff碱反应获得EPL-PBA（图1b），并通过1H NMR确定化学结构。如图1c所示，在EPL-PBA上检测到7.70 ppm和7.30 ppm处芳氢的新特征峰。取代度为……

结论

鉴于生物瓣膜面临的血栓形成、氧化应激和炎症反应等局限性，本研究通过整合糖萼模拟水凝胶涂层与炎症响应性黄芩苷释放，设计了一种多功能心包（BA@ALG-PP）。合成的BA@EPBA纳米颗粒富含氨基，通过邻苯二酚-胺反应共价固定到生物瓣膜上，并在ROS升高条件下实现黄芩苷的按需释放。糖萼模拟层……

伦理声明

本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经四川大学医学伦理委员会批准。（批准号：KS20240400）

利益冲突

所有作者声明他们没有利益冲突。

CRediT作者贡献声明

Lepeng Chen：撰写——审稿与编辑，撰写——原稿，方法论，形式分析，数据整理，概念设计。Yanchang Feng：方法论，形式分析。Xueyu Huang：方法论，形式分析。Daisong Jiang：方法论，形式分析。Cheng Zheng：撰写——审稿与编辑，监督，资金获取。Yunbing Wang：监督，资金获取。

Lepeng Chen | Yanchang Feng | Xueyu Huang | Daisong Jiang | Cheng Zheng | Yunbing Wang