巨噬细胞整合三维球体模型：细菌接种下抗菌效力、细胞毒性与免疫调节作用的同步评估

《Acta Biomaterialia》：A Macrophage-Integrated 3D Spheroid Model Inoculated with Bacteria for Simultaneous Evaluation of Antibacterial Efficacy, Cytotoxicity, and Immunomodulation

　　

摘要传统的抗菌材料测试通常依赖于单独的细菌实验和二维（2D）哺乳动物细胞培养。虽然这些方法作为一线筛查工具至关重要，但它们无法捕捉宿主接触型抗菌材料所遇到的三维（3D）组织结构、扩散限制、细胞外基质重塑以及固有免疫相互作用。在此，本研究引入了一种含巨噬细胞的 3D 球状体模型，旨在同时评估抗菌效力、宿主细胞细胞毒性和免疫反应。这种三组分球状体由 DU 145 上皮细胞、THP-1 衍生的 M0 型巨噬细胞和大肠杆菌（E. coli）组成。利用扫描电子显微镜和扫描离子电导显微镜表征了巨噬细胞整合对球状体结构的影响，揭示了显著的生物物理重塑，表现为基质压实增强和表面致密化。静电性质的变化以及荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖（FITC-dextran）渗透减少进一步支持了这些结构改变，表明屏障功能增强。在大肠杆菌挑战后，驻留巨噬细胞表现出功能可塑性，极化为 M1 型表型以抑制细菌定植。随后，该平台被用于评估 PA-PQ-37，一种阳离子抗菌涂层。与 2D 单层细胞相比，含巨噬细胞的球状体在涂层上保持了结构完整性和活细胞酯酶活性，同时表现出可恢复细菌负荷降低。该模型进一步区分了阳离子聚合物、氨苄西林和阿奇霉素引起的巨噬细胞相关反应，包括炎症和促消退样标记物谱。这一无动物平台补充了传统的抗菌和细胞毒性实验，支持在组织样、免疫响应微环境中对宿主接触型抗菌生物材料进行综合评估。

意义声明抗菌生物材料通常使用简化的细菌实验和 2D 哺乳动物细胞培养进行评估，这些方法无法重现体内遇到的组织结构、扩散屏障、细胞外基质重塑或免疫监视。这一局限性可能导致对抗菌效力和宿主细胞相容性的评估不准确。在本研究中，我们开发了一种整合巨噬细胞的 3D 感染球状体模型，将驻留免疫细胞纳入组织样微环境中以评估生物材料。该模型捕捉了巨噬细胞驱动的球状体压实、基质重塑、细菌限制和感染响应性免疫极化。利用这一平台，我们证明阳离子 PA-PQ-37 涂层在 2D 实验中表现出高度细胞毒性，但在具有巨噬细胞功能的 3D 球状体中耐受性良好，同时保留了抗菌活性。该模型还区分了具有不同免疫调节谱的抗菌剂，包括炎症、中和及促消退反应。这项工作提供了一种生理相关的策略，用于在传统的细菌杀灭和细胞毒性终点之外评估抗菌生物材料。

引言抗菌素耐药性危机的日益严峻，加上新抗生素发现率的下降，已催生出对替代抗菌策略的迫切需求，包括活性和多功能生物材料[1]。传统抗生素通常通过靶向特定的细菌途径发挥作用。例如，包括青霉素、头孢菌素和碳青霉烯类在内的β-内酰胺类抗生素，模拟青霉素结合蛋白的 D-Ala-D-Ala 底物，并与活性位点丝氨酸残基共价酰化，从而抑制肽聚糖交联并诱导细胞壁不稳定和渗透性裂解 [2]。大环内酯类抗生素，如阿奇霉素和红霉素，结合在 50S 核糖体亚基的新生肽链出口通道内，阻断肽链延伸并停滞蛋白质合成 [3]。
与这些靶点特异性抗生素不同，新兴的抗菌材料，如阳离子聚合物、膜破坏肽和接触活性涂层，通常通过更广泛的物理化学机制消除细菌，包括膜破坏、静电相互作用和接触介导的杀灭 [[4], [5], [6]]。除了直接的杀菌活性外，许多抗菌剂还能影响宿主免疫反应。例如，据报道抗菌肽具有免疫调节和致敏特性 [7]。除了杀灭微生物外，它们还可能通过招募免疫细胞、调节细胞因子产生和作为免疫佐剂来调节固有免疫和适应性免疫。因此，抗菌评估应平衡抗菌效力、宿主细胞相容性和免疫调节。
传统的二维（2D）细胞培养系统无法满足这一要求，因为它们无法重现原生组织的物理屏障、扩散梯度、细胞 - 细胞相互作用和多细胞结构 [[8], [9], [10], [11], [12], [13]]。在 2D 单层细胞中，细胞直接且均匀地暴露于抗菌剂，缺乏体内存在的保护性细胞外基质、组织样结构和细胞间连接。因此，2D 实验可能会高估细胞毒性，特别是对于接触活性或高度阳离子的抗菌材料 [14]。此外，传统的 2D 培养不适合评估抗菌剂的免疫调节作用，特别是当免疫细胞缺失或未充分整合到模型中时。虽然动物模型提供了全身生理相关性，但它们仍然昂贵、低通量、受伦理限制，并且在替代（Replacement）、减少（Reduction）和优化（Refinement）的 3R 原则下越来越受到不鼓励 [15]。
需要稳健的体外系统来补充传统的抗菌实验和 2D 细胞毒性测试，同时减少对动物实验的依赖。三维（3D）球状体和类器官模型提供了一种有前景的方法，因为它们更好地重现了细胞 - 细胞相互作用、组织样结构以及氧气、营养物、代谢物和治疗剂的生理梯度 [16,17]。然而，许多当前的 3D 感染模型缺乏功能性的免疫成分 [18]。这是一个主要局限，因为在免疫功能缺陷系统中测试免疫调节性抗菌材料无法捕捉细菌定植、免疫激活、炎症消退和宿主细胞损伤之间的动态相互作用。
巨噬细胞是固有免疫的关键效应细胞，参与细菌清除、炎症调节、细胞外基质（ECM）重塑和组织修复。其功能状态可响应微生物和局部环境信号而变化，从而影响炎症是被放大、控制还是消退 [19]。最近使用肿瘤球状体模型的研究表明，巨噬细胞浸润可通过基质金属蛋白酶介导的降解和胶原纤维重排显著改变 ECM 组织。改变的 ECM 组织和局部运输特性从而影响治疗渗透和反应 [20]。这些观察支持开发含巨噬细胞的 3D 感染模型作为评估直接接触宿主组织的抗菌材料的补充平台，包括植入物涂层、伤口接触材料和局部递送抗菌配方。
鉴于接触活性抗菌涂层在生物医学设备和组织接触材料中的应用日益增加，评估其抗菌性能以及潜在的宿主反应变得尤为重要。植酸聚季铵盐 -37（PA-PQ-37）是一种基于植酸的阳离子聚合物涂层系统，其中植酸中的负电荷磷酸基团与阳离子聚合物网络相互作用，形成功能性抗菌表面。接触活性阳离子涂层可通过与细菌膜相互作用抑制细菌生长。然而，其高局部电荷密度也可能在简化的 2D 培养中损伤哺乳动物细胞。因此，PA-PQ-37 被作为模型材料研究，以验证免疫整合的 3D 平台是否能提供关于抗菌效力和宿主细胞相容性的综合评估。
在本研究中，选择 DU 145 细胞作为可重复的上皮成分，能够生成稳定且尺寸可控的球状体。我们开发了一种整合巨噬细胞的 3D 多细胞球状体系统，作为抗菌材料评估的生理相关组织替代物。我们假设，整合固有免疫细胞不仅能提供免疫学响应，还会通过增强组织压实和细胞外基质密度来改变球状体的生物物理特性，从而创建对材料诱导细胞毒性更具韧性的屏障。为了测试这一假设，通过绘制大肠杆菌（E. coli）的空间分布，研究了巨噬细胞整合（DU 145 + M0）与无巨噬细胞球状体中模型细菌的定植动态。然后，将该巨噬细胞整合的 3D 感染模型应用于在组织样环境中同时评估急性细胞毒性和抗菌效力。作为概念验证，我们评估了阳离子接触杀灭涂层 PA-PQ-37 在治疗和预防设置中的性能。最后，应用 3D 模型比较不同抗菌剂的免疫调节谱，包括氨苄西林、阿奇霉素和聚季铵盐 -2（PQ-2），旨在区分诱导急性炎症反应的药剂与支持炎症消退的药剂。

章节片段
材料与方法
材料和试剂
人前列腺癌细胞 DU 145（Procell，中国武汉）在杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM，Bio-Channel Biotechnology，中国南京）中培养，补充 10% 胎牛血清（FBS，Bio-Channel Biotechnology）、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素。人单核细胞系 THP-1（Procell）在罗氏公园纪念研究所培养基（RPMI 1640，Bio-Channel Biotechnology）中培养，补充 10% FBS。所有细胞培养均在 37°C、5% CO2 下维持。佛波尔

含巨噬细胞的三维多细胞球状体的工程化
为了建立一个生理相关的平台来评估抗菌材料，设计了一种含巨噬细胞的三维共培养系统，以重现宿主组织致密的多细胞结构和免疫复杂性。选择 DU 145 上皮细胞作为结构细胞成分，因为它们形成均匀且可重复球状体的能力强健。我们首先调查了巨噬细胞是否能成功整合到三维球状体中

讨论
抗菌生物材料的评估仍受限于传统体外实验的生理相关性不完整。宿主细胞反应和抗菌活性通常在 2D 单培养中分开评估，其中细胞直接暴露于抗菌表面或可溶性试剂，而缺乏多细胞结构、扩散梯度或免疫监视。在本研究中，我们开发了一种含巨噬细胞的三维球状体感染模型，以及

结论
提出了一种含巨噬细胞的三维多细胞球状体模型，用于在模拟感染微环境中同时评估细胞毒性和抗菌效力。实验结果表明，M0 巨噬细胞的整合驱动了显著的生物物理重塑，包括球状体压实、表面平滑和细胞外基质重组。这种结构适应减轻了接触活性阳离子涂层（如 PA-PQ-37）典型的急性细胞毒性。

利益冲突
没有利益冲突需要声明。

数据可用性
当前研究的数据可向通讯作者提出合理请求获取。

CRediT 作者贡献声明
Xiaoyan Yang：撰写 - 原稿，可视化，方法论，数据整理，概念化。Ke Ning：可视化，方法论，数据整理。Yuanyuan Xie：验证，调查，数据整理。Bowen Ran：方法论。Mingzhu Wang：方法论。Liqun Xu：撰写 - 审阅与编辑，概念化。Ling Yu：撰写 - 审阅与编辑，项目管理，资金获取，概念化。
Xiaoyan Yang|Ke Ning|Yuanyuan Xie|Bowen Ran|Mingzhu Wang|Liqun Xu|Ling Yu