骨髓中低频率受寄生细胞在减毒活大里曼原虫Cen?/?疫苗免疫接种后改变髓系造血

《iScience》：Low-frequency parasitized cells in bone marrow alter myelopoiesis following immunization with the live attenuated Leishmania major Cen?/? vaccine

　　

# 要点

- 用LmCen?/?疫苗免疫可在骨髓中诱导强烈的粒细胞生成
- 皮内接种后可在骨髓中检测到利什曼原虫寄生
- 用LmCen?/?疫苗免疫可将骨髓单核细胞预激为炎症型谱

# 摘要

利什曼病目前缺乏有效疫苗。我们开发了一种活体减毒的利什曼原虫Centrin缺失株（LmCen?/?），通过产生IFN-γ的效应T细胞，在小鼠和犬模型中证明其安全性和保护力。由于持续低水平感染可支持持久免疫，我们调查了骨髓中的潜伏原虫和免疫重塑。双单细胞RNA测序在皮内接种致病性LmWT或减毒LmCen?/?后28天检测到骨髓中被寄生的细胞。流式细胞术显示，与LmWT感染相比，LmCen?/?免疫后骨髓粒细胞生成增加。细胞-细胞通讯分析提示增强的granulin-Sort3信号可能作为此反应的潜在驱动因素。LmCen?/?免疫小鼠的骨髓单核细胞在共培养中可高效清除致病性LmWT原虫，这与训练性固有免疫的诱导一致。这些发现表明骨髓是抗利什曼免疫编程的活跃位点，并提示LmCen?/?疫苗通过协调适应性免疫和固有免疫机制促进持久保护。

# 图形摘要

# 引言

利什曼病是一种被忽视的热带病，由利什曼属（*Leishmania*）的血液传播寄生虫引起。据估计，利什曼病影响全球90多个国家，包括美国，美国现在被认为是该病的流行区。尽管其影响广泛，但目前尚无FDA批准的适用人类疫苗。最近，我们的实验室开发了一种基于CRISPR介导的Centrin基因敲除的活体减毒疫苗，该疫苗基于皮肤嗜性种*Leishmania major*（LmCen?/?）。LmCen?/?已被证明是安全的，即使在免疫缺陷动物中亦然，并在临床前模型中对抗同源和异源挑战提供长期保护。

除了皮肤、肝脏和脾脏等已明确描述的感染部位之外，新兴证据表明利什曼原虫也可在骨髓中持续存在。在*Leishmania donovani*感染的小鼠模型中，内脏利什曼病的致病因子已被报道在骨髓中存在利什曼DNA和活原虫。这些研究证明了造血干细胞（HSC）中原虫的存在，原虫可能通过吞噬受体获得并产生一氧化氮。此外，原虫的持续存在会诱导应急造血，导致适应性粒细胞生成增加，正如在*L. major*（皮肤利什曼病的致病因子）感染模型中所观察到的。皮肤利什曼病（CL）病灶会招募大量中性粒细胞、炎症单核细胞、巨噬细胞和单核细胞来源的树突状细胞（DC），这表明这种迁移需要改变的骨髓粒细胞生成和动员。然而，很少有研究探讨过骨髓中前体细胞的频率：LSK（Lin?, Sca-1+, c-Kit+）、多能、粒细胞/单核细胞/DC前体细胞（多能前体细胞[MPPs]、粒细胞-单核细胞前体细胞[GMP]、单核细胞-树突状细胞前体细胞[MDP]）；成熟输出如中性粒细胞、Ly6Chi单核细胞、Ly6Clo单核细胞、这些细胞的输出，以及它们在骨髓中的功能预激。*L. donovani*引起的慢性内脏利什曼病期间骨髓中的应急造血导致HSC扩增和分化偏向调节性髓系前体细胞，产生感染容许性单核细胞并促进原虫持续存在。骨髓环境的改变暗示其参与抗利什曼免疫，包括活体减毒疫苗诱导的免疫。

炎症单核细胞（Ly6C+ CCR2+CX3CR1+）在利什曼原虫发病过程中根据感染背景发挥不同作用。在初次感染期间，这些细胞作为原虫复制的容许性宿主细胞。*L. major*主动抑制单核细胞成熟，阻止MHCII上调，维持有利于原虫存活和增殖的未成熟表型。相反，在免疫小鼠的二次感染期间，同一单核细胞群在IFN-γ依赖方式下快速产生诱导型一氧化氮合酶（iNOS），有效杀死原虫，无需完全成熟为DC。这展示了炎症单核细胞在决定感染结局方面的关键可塑性，并暗示了其在疫苗诱导免疫中的作用。

骨髓中的免疫调节已在多种感染模型中被报道。卡介苗（BCG）、麻疹、腮腺炎和风疹（MMR）疫苗的接种研究，以及近期基于mRNA的COVID-19疫苗的研究，揭示了骨髓驻留免疫细胞群和前体细胞的持续改变。BCG疫苗接种的保护效应被称为"训练性免疫"，由单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞等固有免疫细胞介导。类似地，MMR疫苗接种导致CD14+单核细胞和NK细胞的转录组变化，最显著的是γδ T细胞中TNF和IFN-γ的显著产生。这些研究共同表明疫苗接种后的长期免疫重编程，这也可能发生在活体减毒LmCen?/?疫苗接种后。

训练性免疫在利什曼原虫感染中的作用仍然在很大程度上未被探索，尽管新兴证据暗示了其重大潜在影响。训练性免疫的特征是通过组蛋白修饰和转录变化对固有免疫细胞进行表观遗传重编程，这可能会从根本上改变骨髓对利什曼原虫的造血反应。由于利什曼原虫感染会大幅调节骨髓造血干细胞和前体细胞（HSPCs），促进感染适应性粒细胞生成并产生容许性单核细胞宿主细胞，训练性免疫机制可能能够重编程这些反应。粒细胞生成的表观遗传印记，如β-葡聚糖处理所证明的，表明先前病原体暴露可能改变利什曼原虫感染期间髓系细胞的产生和功能。理解这些机制可以为疫苗开发策略提供参考，可能通过靶向固有免疫的表观遗传编程，提供异源保护并优化对内脏和皮肤利什曼病的免疫反应。

关于BCG疫苗训练性免疫的研究发现，系统性扩散对于最佳诱导训练性免疫至关重要。在动物模型中静脉注射BCG相比皮内途径提供了对结核分枝杆菌（Mtb）的优越保护，表明系统性扩散增强了免疫训练效果。该机制涉及BCG菌血症使骨髓HSC获得接触机会，从而发生表观遗传和转录重编程。该过程产生具有增强病原体清除能力的训练性髓系细胞，通过所谓的"早期清除"——即在感染建立之前消灭病原体的能力。

新生儿BCG疫苗接种显示出比成人接种更优越的保护效果，这可能归因于新生儿不成熟的上皮屏障增强了系统性扩散。训练性HSC产生固有髓系细胞，表现出对Mtb的优越清除能力，而系统性扩散使适应性和固有免疫区室均能形成记忆。这些发现与LmCen?/?等皮肤嗜性疫苗株相关，并提示优化免疫原的系统性扩散可能显著增强训练性免疫诱导，通过全面的造血重编程提供更广泛的抗多种病原体保护。

LmCen?/?原虫在皮内接种后是否在骨髓中建立生态位目前尚不清楚。我们假设骨髓可能作为持续LmCen?/?原虫的长期生态位，从而诱导细胞命运重编程以利于疫苗免疫。在本研究中，通过双单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，我们证明少量致病性LmWT和疫苗LmCen?/?原虫在骨髓中找到生态位，特别是在HSC和单核细胞群中。有趣的是，我们观察到利什曼原虫感染和LmCen?/?疫苗接种差异性塑造骨髓免疫景观。虽然两种情况均诱导应急造血，但疫苗接种后粒细胞生成增强。相比之下，升高的巨核细胞生成似乎由LmWT感染诱导。巨核细胞生成产生的血小板通过TLRs具有病原体感知功能。这些见解可能帮助我们理解疫苗保护和长期免疫产生的机制。

# 结果

## LmWT和LmCen?/?感染小鼠骨髓的细胞图谱

*L. donovani*原虫的静脉接种实验研究表明，在慢性感染阶段HSC中携带原虫。为了检测骨髓细胞是否同样是皮肤利什曼病持续感染的偏好生态位，我们用1×10?致病性*L. major*或活体减毒疫苗株LmCen?/?前鞭毛体皮内或静脉感染C57Bl/6小鼠（图1A）。感染后28天分离骨髓，对富集的单核细胞群进行scRNA-seq（图1A）。Illumina测序显示每细胞平均15,000个reads（图1B），对四种感染合并reads进行均匀流形近似和投影（UMAP）显示细胞群分布相似（图1C）。Cell Ranger分析后结合Seurat R包的注释工具进行聚类（图1D和1E）并利用特征标记基因注释细胞类型。点图（图1F–1T）将细胞群解析为15个不同簇，重叠极小。

**图1** LmWT或LmCen?/?感染小鼠骨髓细胞簇的鉴定

(A) 实验设计，C57Bl/6小鼠（n = 3）皮内或静脉感染LmWT或LmCen?/?原虫后，骨髓穿刺液经10× Genomics scRNA-seq分析。
(B和C) Illumina测序的reads计数（B）和特征计数（C）。
(D) 来自Seurat R包scRNA-seq的UMAP图，显示四种不同感染的细胞聚类。
(E) UMAP图，通过无监督聚类显示四种感染的细胞分布为15个簇。
(F–T) 点图，描绘用于注释各簇细胞群的前50个标记基因的表达。

## scRNA-seq分析揭示LmWT和LmCen?/?接种后骨髓细胞类型的分布

### LmWT和LmCen?/?感染在骨髓中产生可比拟的细胞组成

通过选择适当的kNN（k-最近邻）分辨率进行异质细胞群的聚类，以区分主要细胞类型（图2A）。基于此分析，共鉴定出15个不同的细胞簇。由于我们的目标是在GEM（Gel Bead-in-Emulsion）文库制备步骤前降低细胞输入的复杂性，我们因此观察到主要由单核细胞、中性粒细胞、HSC、巨核细胞和嗜碱性粒细胞组成的细胞簇（图2B）。预期地，T细胞和B细胞群在研究采样的细胞群中耗竭。致病性毒株和疫苗株细胞簇的比较显示，两种感染在皮内和静脉感染中均产生可比拟的各细胞群频率（图2C）。

**图2** LmWT或LmCen?/?感染小鼠骨髓中鉴定细胞簇的注释

(A) UMAP图，显示基于标记基因表达进行细胞类型注释。从分析的5–7千个细胞中鉴定出15个簇。
(B) LmWT和LmCen?/?感染中的细胞类型组成。
(C) 四种感染中每个簇的细胞数。括号中显示各簇的百分比。

## 双scRNA-seq揭示皮内接种LmWT或LmCen?/?后小鼠骨髓中被寄生的多能性和髓系细胞

为基于转录组分析检测骨髓中被寄生的细胞，我们构建了包含小鼠（GRCm38）和利什曼（基因组组装ASM22713v2，登录号GCF_000227135.1）基因组的拼接混合参考基因组图谱，如我们之前的研究所示。叠加寄生虫转录本的UMAP与基于kNN的小鼠细胞簇相结合，使得能够检测感染后28天从骨髓中分离的被寄生细胞（图3A）。Illumina测序reads中识别的寄生虫转录本作为补充信息列出。与之前的研究一致，我们在已知携带原虫的吞噬细胞群中检测到被寄生的细胞，包括巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞，以及一小部分HSC（图3B，以UMAP的放大区域显示）。在皮内和静脉感染中，我们观察到输入细胞的0.6%–1.2%被LmWT或LmCen?/?原虫寄生（图3C）。每细胞获得的中位数总reads范围为20,869–33,994，然而每种感染中仅检测到单个利什曼特异性中位数UMI。寄生虫UMIs对应利什曼基因组中的45–73个ORFs（图3C）。

**图3** LmWT或LmCen?/?感染小鼠骨髓中被寄生细胞群的UMAP可视化

(A) 通过将reads比对到拼接参考基因组来鉴定被寄生的细胞。

检测到寄生虫转录本的细胞群已被标记。(B) 显示检测到的寄生虫转录本的选定细胞群的放大图像及其细胞群标识。(C) 列出每种感染中来自宿主和寄生虫的测序读数数量以及骨髓中受感染细胞的百分比。

利用流式细胞术检测LmWT和LmCen?/?感染中受寄生虫侵染的多能细胞和髓系细胞

为了检测寄生虫随时间到达骨髓的情况，我们使用了表达荧光蛋白mCherry的转基因报告寄生虫：LmWTmCherry和LmCen?/?mCherry。每只小鼠向小鼠耳部皮内注射1×10?寄生虫。在感染后14、28或42天（d.p.i.），收获骨髓并进行流式细胞术染色。首先，去除双联体和死细胞。利用表面标记物CD11b，通过流式细胞术分析鉴定髓系细胞群（CD11b?）以及HSCs和多能祖细胞（包含在CD11b?群体中）（图S1）。使用非转基因寄生虫系感染来排除由自发荧光产生的假象（图S1）。在髓系细胞群（CD11b?）中，我们在感染组中观察到寄生虫侵染细胞随时间的存在，分别在14（图4B）、28（图4C）和42 d.p.i.（图4D）。同样，HSCs和祖细胞（CD11b?）在14（图4E）、28（图4F）和42 d.p.i.（图4G）时，通过检测到mCherry阳性信号显示出寄生虫侵染，在LmWTmCherry和LmCen?/?mCherry感染的动物中均有观察到。具体而言，在14 d.p.i.时，仅在4只LmCen?/?感染动物中的1只的CD11b?细胞中检测到寄生虫，42 d.p.i.时为4只中的2只，而仅有一只LmWTmCherry感染小鼠在28 d.p.i.时显示阳性信号（图4H）。由于阳性细胞稀少，必须对阳性群体的阈值进行限制以确保获得真实的阳性信号。因此，我们还报告了mCherry的平均荧光强度（MFI）。组间的MFI差异可能提示寄生虫侵染细胞在分析mCherry?细胞百分比时无法被区分。LmCen?/?mCherry感染动物的CD11b?细胞中的mCherry MFI在14和42 d.p.i.时显著增加。与此同时，LmWTmCherry感染动物仅在42 d.p.i.时显示出mCherry MFI的增加（图4I）。受侵染的CD11b?细胞在百分比和mCherry MFI方面均有所增加。在14 d.p.i.时，6只用LmCen?/?寄生虫免疫的小鼠中有5只显示出明显信号，28 d.p.i.时6只中有1只仍可检测到信号，42 d.p.i.时至少6只中有2只可检测到信号，LmWT感染中的CD11b?受侵染细胞在14 d.p.i.时6只小鼠中有3只显示出增加（图4J）。mCherry MFI分析显示寄生虫存在于LmCen?/?组中在14 d.p.i.时增加，以及在LmWT和LmCen?/?感染组中在42 d.p.i.时均有增加（图4K）。

图4 检测感染LmWT或LmCen?/?寄生虫小鼠骨髓中的受侵染细胞
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实验设计示意图（A）。C57Bl/6小鼠感染1×10? LmWT或LmCen?/?寄生虫，两者均表达荧光蛋白mCherry。动物在感染后14、28和42天（d.p.i.）被处死，骨髓被收获。在每个时间点进行流式细胞术分析以鉴定CD11b?和CD11b?群体，分别包含髓系细胞和（*）包含祖细胞的非髓系细胞。通过mCherry表达鉴定受侵染细胞。展示代表性点图，其中在髓系细胞中于14 d.p.i.（B）、28 d.p.i.（C）和42 d.p.i.（D）时观察到受侵染细胞。同样，在CD11b?细胞中于14 d.p.i.（E）、28 d.p.i.（F）和42 d.p.i.（G）时观察到受侵染细胞。分别显示CD11b?和CD11b?群体的mCherry?细胞百分比（H）以及mCherry信号的MFI（I），以及CD11b?和CD11b?群体的相应数据（J和K）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。实验进行了两次，每次实验中每组（n = 5–8）分离骨髓。

LmWT和LmCen?/?感染在骨髓多种细胞类型中引发不同的转录活性

为了评估疫苗接种动物和感染动物之间的差异基因表达，我们生成了先前鉴定的15个细胞群的火山图。细胞群0、1、2、3、4、5和6（图5A-5G）显示LmWT和LmCen?/?感染之间最显著的变化。细胞群7、8、9、10、11、12、13和14（图S2A-S2H）在两种感染之间未显示基因表达的显著变化。此外，使用CellChat进行的通讯通路分析显示，与LmWT感染组相比，LmCen?/?疫苗接种组的骨髓中趋化因子（CCL）、补体和颗粒素通路富集（图5H）。

图5 感染LmWT或LmCen?/?寄生虫小鼠骨髓不同细胞群的转录活性
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（A-G）从LmWT和LmCen?/?感染后28天分离的骨髓细胞群体（细胞群0-6）中的转录活性差异以DESeq2分析的火山图展示。转录本丰度的变化以Log?倍数变化（x轴）表示，显著性值以Log??P（y轴）表示。展示了代表单核细胞和中性粒细胞群体的细胞群（细胞群0-6）。（H）CellChat分析显示了不同细胞群之间的通讯概率。LmWT和LmCen?/?感染之间差异最大的细胞信号网络按从高到低排序绘制。在任一感染中富集的主要信号网络被突出显示。

细胞-细胞通讯网络鉴定了LmWT和LmCen?/?信号传导中不同的颗粒素信号

为了确定骨髓细胞功能差异的本质，我们对感染后28天获得的scRNA-seq数据上富集的通路使用CellChat工具进行了进一步分析。该分析揭示了不同通路中受体和配体的差异表达。

颗粒素信号传导（图6A-6E）以颗粒素（GRN3）与其受体SORT1的相互作用为特征。我们观察到GRN3表达在LmCen?/?注射小鼠的中性粒细胞和单核细胞（细胞群9）中明显存在（图6A和6B），而在LmWT中，同一细胞群中完全不存在（图6D和6E）。有趣的是，细胞群9中SORT1的表达在这些组之间没有差异（图6B和6E，红色虚线）。当对所有细胞群中的通讯概率进行排序时（图6F），我们观察到GRN3主要在LmCen?/?感染的细胞群2中高表达，而通讯接收方（基于SORT1表达）广泛分布在涵盖中性粒细胞群体的细胞群中。这种基于GRN3表达的通讯在LmWT感染中减弱（图6F）。因此，我们认为两种感染的颗粒素信号表达谱之间存在显著差异。

图6 LmWT和LmCen?/?感染导致细胞通讯网络显著改变
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（A）热图显示了LmCen?/?寄生虫皮内接种的C57Bl/6小鼠骨髓中不同细胞群中促颗粒素（颗粒素的前体，GRN）与其结合伙伴SORT1之间的通讯概率。（B和C）小提琴图显示了单个细胞群中PGRN和SORT的表达（B），红色虚线显示中性粒细胞/单核细胞群（细胞群9）中GRN的表达，各个细胞群的图例以颜色编码显示（C）。（D）热图显示了LmWT寄生虫皮内接种的C57Bl/6小鼠骨髓中不同细胞群中GRN-SORT1的通讯概率。（E）小提琴图显示单个细胞群中PGRN和SORT的表达，红色虚线显示中性粒细胞/单核细胞群（细胞群9）中GRN表达缺失。（F）热图显示在LMWT感染中中性粒细胞/单核细胞/红系细胞群中GRN-SORT1通讯的缺失。（G）热图显示LmCen?/?感染中不同细胞群中补体（C3、ITG）与受体之间的通讯概率。（H）小提琴图显示单个细胞群中C3、C4和受体ITG的表达。（I）热图显示LmWT感染中不同细胞群中C3和ITG之间的通讯概率。（J）小提琴图显示单个细胞群中补体及其受体的表达。（K）热图显示在LMWT感染中多个细胞群中C3-ITG通讯的缺失。（L）热图显示LmCen?/?感染中不同细胞群中CCL与受体之间的通讯概率。（M）小提琴图显示单个细胞群中CCL-CCR的表达。（N）热图显示LmWT感染中不同细胞群中CCL-CCR之间的通讯概率。（O）小提琴图显示单个细胞群中CCL-CCR的表达。（P）热图显示LmWT感染中CCL-CCR通讯的差异。（Q）气泡图显示含单核细胞簇中LmCen?/?（上）和LmWT（下）中irf7、ifit2、bst2和irf5的差异表达。

补体信号传导基于补体级联蛋白组分的基因表达进行评估：C3和C4亚基，以及CR2、ITGAM3、IGAX2和ITGB2。虽然这些基因在单个细胞群中的表达在细胞群之间未显示出不同的分布模式（图6G-6J），但细胞通讯显示出了不同的分布模式。在LmCen?/?组中，补体通讯的发送方/接收方方向从细胞群2到细胞群12，从细胞群4到细胞群12，从细胞群2到细胞群1，以及从细胞群1到细胞群10（图6K）。而在LmWT组中，通讯似乎仅限于从细胞群1到细胞群10（图6K）。在两种情况下，通讯在包含中性粒细胞的细胞群中均可检测到。

趋化因子信号传导在各组之间也显示出不同的表达模式（图6L-6P）。趋化因子CCL3、CCL9、CCL6和CCL2以及趋化因子受体CCR1和CCR2在LmCen?/?和LmWT组的每个单个细胞群分析中看似相似（图6L-6O）。然而，发送方-接收方通讯分析在两种感染中有所不同（图6P）。LmCen?/?组显示趋化因子通讯强烈地从细胞群3到细胞群0（中性粒细胞/红系细胞到巨噬细胞/中性粒细胞），而LmWT组显示趋化因子通讯从细胞群0到细胞群2（单核细胞中性粒细胞到中性粒细胞/单核细胞/红系/B细胞）（图6P）。

LmCen?/?和LmWT感染组之间干扰素相关基因的不同表达，如干扰素调节因子7（irf7）、干扰素诱导蛋白含四螺旋肽重复2（ifit2）和骨髓基质细胞抗原2（bst2，图S3），被观察到。计算了所有包含单核细胞的细胞群（细胞群1、2和9）的平均基因表达。irf7和bst2的平均表达在LmWT骨髓的单核细胞中增加（图S3），而LmCen?/?骨髓中的单核细胞显示出irf5表达的增加（图6Q）。总之，趋化因子通讯、颗粒素通路和干扰素相关基因的差异区分了两种感染，表明两种感染导致骨髓出现不同的反应。

LmCen?/?和LmWT感染在骨髓中引起不同的分化程序

为了鉴定毒力感染和疫苗接种对骨髓免疫景观的影响，我们通过流式细胞术评估了不同的细胞群体，包括干细胞、多能细胞和完全分化的免疫细胞，以获取骨髓细胞反应的概览（图7A）。Lineage? Sca1? c-Kit?细胞，也称为LSK细胞，包含多种干细胞和祖细胞，是流式细胞术分析中其他多能细胞群体的前体门控群体（图S4A）。在14（图7B）、28（图7C）或42 d.p.i.（图7D）时，各组之间未观察到LSK细胞的差异（图7E）。从LSK群体中分选出七种细胞类型（图S4A）。根据其CD16/32和CD34表达，我们鉴定了共同髓系祖细胞（CMPs；CD16/32? CD34?）、粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMPs；CD16/32? CD34?）以及巨核细胞-红细胞祖细胞（MEPs；CD16/32? CD34?）。CMP、GMP和MEP均未显示统计学显著差异（图S4B）。然后，根据其CD150和CD48表达，鉴定了长期造血干细胞（LT-HSCs；CD48? CD150?）、短期造血干细胞（ST-HSCs；CD48? CD150?）以及髓系多能祖细胞2和3（MPP-II和MPP-III；CD48? CD150?和CD48? CD150?）。

在感染后28天（图7I），LmCen?/?组（15.05% ± 5.02）和LmWT组（15.9% ± 4.82%）的长期造血干细胞（LT-HSCs）均较naive组（8.52% ± 2.34%）有所增加；而在感染后42天，仅LmCen?/?组（17.76% ± 1.96%）仍显著高于naive组（14.37% ± 1.63%）。在同一时间点，LmCen?/?组的短期造血干细胞（ST-HSCs）比例（52.78% ± 5.05%）高于LmWT组（39.01% ± 7.3%）和naive组（42.1% ± 6.85%）（图7J）。感染后28天时，巨核细胞和红细胞谱系的前体细胞MPP2s在LmWT组（12.21% ± 10.15%）有所增加，但在LmCen?/?组（5.35% ± 4.29%）中未见此现象，后者与同一时间点的naive动物相似（6.4% ± 1.75%）（图7K）。髓系祖细胞MPP3在感染后42天时，LmCen?/?组（25.73% ± 3.15%）较LmWT组（39.66% ± 7.08%）和naive组（38.17% ± 6.93%）均有所减少（图7L）。综合以上数据表明，LmWT和LmCen?/?感染时骨髓细胞的组成存在差异。

图7 皮内接种LmCen?/?寄生虫可增强骨髓中的应急造血

巨核细胞生成、红细胞生成和髓系细胞生成的示意图（A）。长期造血干细胞（LT-HSCs）能够自我更新或分化为短期造血干细胞（ST-HSCs），后者也称为多能祖细胞1（MPP1）。进一步分化可产生多能祖细胞2和3（分别为MPP2和MPP3），最终生成4种不同的细胞类型。MPP2s最终分化为巨核细胞和红细胞，而MPP3s则分化为中性粒细胞和单核细胞。代表性点图显示Lineage负（Lin-）Sca-1+ c-Kit+细胞，这些细胞代表所有祖细胞和造血干细胞的总和，也称为LSK细胞。图（E）显示了感染后14天（B）、28天（C）和42天（D）LSK细胞相对于Lin-细胞的百分比。此外，感染后14天（F）、28天（G）和42天（H）的代表性点图展示了特定祖细胞如LT-HSCs（I）、ST-HSCs（J）、MPP2（K）和MPP3（L）相对于LSK细胞的百分比。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。实验重复进行了两次，每次从每组分离骨髓（n = 5–8）。

LmCen?/?感染中的髓系造血

来自MPP3祖细胞的后代髓系细胞和来自MPP2的巨核细胞，使用细胞外标志物Ly6C（单核细胞）、Ly6G（中性粒细胞）、F4/80（巨噬细胞）和CD41（巨核细胞）进行了评估（圈门策略见图S5）。我们观察到LmWT和LmCen?/?之间存在不同的细胞分布格局。在感染后14天，LmCen?/?组（1.18% ± 0.33%）的单核细胞较LmWT动物（0.87% ± 0.21%）有所增加（图8A和8D）。这一差异在感染后28天时得以维持（图8B和8D），LmCen?/?组的单核细胞比例（1.37% ± 0.36%）高于LmWT组（0.81% ± 0.37%）。感染后42天未发现统计学差异（图8C和8D）。

图8 接种LmCen?/?后单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞数量更多

（A–C）代表性点图显示了感染后24天（A）、48天（B）和72天（C）单核细胞（Ly6G- Ly6C+）和中性粒细胞（Ly6G+ Ly6C-）群体的变化。（D和E）细胞百分比以CD11b+ CD45+髓系细胞为参照进行计算。（F–I）感染后24天（F）、48天（G）和72天（H）的代表性点图显示了（I）巨噬细胞相对于CD11b+ CD45-细胞的百分比。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。实验重复进行了两次，每次从每组分离骨髓（n = 5–8）。

中性粒细胞在LmWT和LmCen?/?感染小鼠之间呈现相似趋势（图8E）。感染后14天时，LmCen?/?组（9.76% ± 2.33%）较LmWT组（6.07% ± 1.44%）有所增加。同样，在感染后28天时，LmWT组（18.45% ± 3.11%）的中性粒细胞比例低于LmCen?/?组（26.75% ± 6.55%）和naive组（24.64% ± 2.02%）。感染后42天时，三组之间未见差异。

巨噬细胞（CD11b+ F4/80+ Ly6C-）直接来源于单核细胞，在两种感染之间呈现不同的分布特征（图8I）。感染后28天时，LmWT组的巨噬细胞减少（0.06% ± 0.03%）（图8G和8I），低于naive组（0.123% ± 0.03%），且显著低于LmCen?/?组（0.15% ± 0.08%）。感染后14天和42天未观察到变化（图8F–8I）。

与LmWT感染相比，LmCen?/?感染中检测到巨核细胞群体减少

还鉴定了巨核细胞（CD41+ CD45hi）（图S5和S6）。感染后14天时，LmCen?/?骨髓中的巨核细胞比例（36.41% ± 5.9%）低于naive组（44.6% ± 2.77%），但LmWT组未见变化（40.9% ± 4.102%）（图9A和9D）。感染后28天时，三组之间巨核细胞群体未见差异（图9B和9D）。感染后42天时，LmCen?/?组的巨核细胞比例（48.75% ± 6.81%）低于LmWT组（64.32% ± 2.66%）（图9C和9D）。

图9 与LmWT感染相比，LmCen?/?组在感染后42天检测到的巨核细胞更少

（A–C）代表性点图显示了感染后24天（A）、48天（B）和72天（C）巨核细胞（CD41+ CD45+）群体的变化。（D）巨核细胞百分比以所有CD45+细胞为参照进行计算。*p < 0.05，***p < 0.001。实验重复进行了两次，每次从每组分离骨髓（n = 5–8）。

LmCen?/?感染导致炎症性单核细胞获得寄生虫杀伤活性

为进一步表征LmWT和LmCen?/?动物中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞之间的转录差异，我们在感染后28天对scRNA-seq数据进行了进一步分析。我们观察到UMAPs中存在细微差异，展示了所有细胞簇（图10A）。随后，我们分离了所有包含单核细胞的簇（簇2和9）（图10B）、中性粒细胞的簇（簇0、1、2、3、4、5、6、8、9、10和12）（图10C）以及巨噬细胞的簇（簇0、1和5）（图10D）。我们观察了Adgre1、Ccr2和Ly6C的表达，因为它们有助于区分不同的亚群。经典单核细胞被报道为Adgre1lo Ccr2hi和Ly6c2hi。经典单核细胞相关表型的基因表达在LmCen?/?单核细胞中高于LmWT感染组（图10B）。在中性粒细胞群体中，LmCen?/?组观察到Ccr2表达升高，而LmWT组显示Ly6C表达增加。最后，LmCen?/?来源的巨噬细胞簇中Adgre1和Ccr2的平均表达量高于LmWT组，这可能与单核细胞来源的巨噬细胞（Adgre1hi Ccr2hi）比例较高有关（图10D）。

图10 疫苗接种动物骨髓中起源的单核细胞在体外更高效地清除致病性利什曼原虫

（A）UMAPs展示了LmWT（上）和LmCen?/?（下）组骨髓所有簇中Adgre1、Ccr2和Ly6C的差异表达。（B–D）这些基因在所有单核细胞（B）、中性粒细胞（C）和巨噬细胞簇（D）中的表达情况。（E）通过从naive和疫苗接种动物中分离单核细胞进行体外利什曼原虫杀伤实验。然后，将单核细胞与带有纳米荧光素酶报告基因的LmWT（LmWTnLuc）共培养，作为寄生虫存活的报告系统。（F）向培养物中加入荧光素后，以相对发光单位（RLU）报告寄生虫存活情况。**p < 0.01。实验重复进行了两次，每次从每组分离骨髓（n = 3–4）。

由于我们在scRNA-seq分析中观察到炎症性单核细胞增加，且流式细胞术数据显示髓系造血增强，我们通过体外杀伤实验测定了骨髓中单核细胞的功能性杀伤能力。在收集骨髓细胞后，我们使用MACs单核细胞富集试剂盒从naive和LmCen?/?接种小鼠中分离单核细胞。然后，我们将这些单核细胞与带有纳米荧光素酶报告基因的LmWT（LmWTnLuc）共培养，以测试这些单核细胞控制体外感染的能力。因此，向培养物中加入荧光素后可检测到存活的寄生虫（图10E）。我们观察到，先前接触利什曼原虫的单核细胞（LmCen?/?接种动物）清除致病性寄生虫的能力更高（7.6 × 106相对发光单位[RLU]），而naive单核细胞为1.02 × 107 RLU（图10F）。

讨论

造血细胞的改变已在多种疫苗中被报道，包括BCG，这表明需要检查骨髓以探索保护性免疫的机制。鉴定利什曼原虫寄生虫疫苗在骨髓中诱导的持续变化，可能揭示除T细胞依赖性免疫外，免疫细胞分化和保护的新型机制。这种由应急造血产生的复杂细胞格局，可能通过来自感染源的信息（如蛋白质、转录本甚至寄生虫本身）直接到达骨髓或接触骨髓，从而启动多能细胞中的特异性分化级联反应。在本研究中，我们展示了在LmWT感染或LmCen?/?疫苗接种后如何引发应急造血，以及两种感染产生的效应细胞比例如何不同。此外，产生的新髓系细胞可能已被预激活，以便在后续感染挑战中更有效地清除寄生虫。

首先，scRNA-seq和流式细胞术数据显示，LmWT和LmCen?/?接种小鼠骨髓中的HSCs和髓系细胞中利什曼原虫的存在极少。此外，感染率在静脉注射和皮内接种之间非常相似（图2），且在两种寄生虫表型之间也相似，表明寄生虫从皮肤向骨髓的扩散并非感染途径或接种寄生虫数量的结果。我们还考虑了在LmWT感染中单核细胞和中性粒细胞从骨髓选择性外迁的可能性（与LmCen?/?感染相比）。我们的观察否定了这一假设，因为在两种感染中未检测到骨髓细胞组成的显著变化。如果选择性外迁发生，我们应该在LmWT和LmCen?/?感染的细胞组成中观察到这一现象。此前已证实利什曼原虫在内脏利什曼病模型中的存在；利什曼原虫donovani被发现存在于慢性感染小鼠骨髓的HSCs中，而LT-HSCs在治疗失败期间作为利什曼原虫infantum的储存所。相反，利什曼原虫major的皮肤感染模型通过限制性稀释检测时，未显示骨髓中存在寄生虫。我们假设不同的结果是由于检测方法的敏感性所致；因此，证明寄生病原体细胞需要从骨髓中通过分离柱富集髓系和HSCs细胞，并通过scRNA-seq在至少每个感染细胞中鉴定出1个寄生虫RNA转录本（图3）。我们还试图在慢性感染小鼠中检测活寄生虫，方法是在感染后28天将骨髓移植至高易感小鼠STAT1?/?小鼠（数据未显示）。然而，我们未能通过限制性稀释在STAT1?/?小鼠中鉴定出任何寄生虫。利什曼原虫major持续性感染的研究表明，利什曼原虫并非活跃复制，而是通过限制性代谢维持休眠状态。只有当iNOS被中和时，寄生虫才会复制。我们的数据与这些观察结果一致，表明少量寄生虫可能意味着骨髓中存在非复制性潜伏感染。

通过scRNA-seq表征的骨髓细胞组成在LmWT或LmCen?/?接种的动物之间，以及皮内或静脉注射接种的动物之间均可比，表明寄生虫的遗传特征和感染途径均不影响骨髓细胞组成的整体格局。鉴于接种途径之间的相似性，我们使用皮内感染模型继续进行验证实验，因其与自然感染更为相似。

尽管未检测到细胞组成的大规模差异，但两种感染中骨髓细胞的转录特征分析揭示了LmWT和LmCen?/?小鼠之间分化的三个主要通路：补体、CCL趋化因子信号传导和颗粒素（颗粒蛋白）信号传导。

补体途径基因的变化表明，疫苗组与野生型感染在固有免疫活性的调控上存在差异，尤其是在C4a和C4b亚型的表达方面。尽管两者分子结构相似，但C4a含有更多氨基，而C4b结合含羟基的抗原，提示两者可能发挥不同的功能。在自身免疫性疾病中，不同的表达特征与疾病发生风险相关。然而，不同表达谱究竟与感染和免疫保护有关，还是由于分子相似性导致识别上的重叠，目前尚不明确。趋化因子（CCL）通路是调控抗原呈递细胞归巢至骨髓以及塑造紧急造血通路的核心因素。我们观察到，LmCen?/?感染与LmWT感染之间最主要的差异在于趋化因子受体CCR1和CCR2的表达，它们在骨髓中髓系细胞群体的比例调控中发挥作用。特别是，CCR1/CCL3（MIP1α）信号在谱系已定向的髓系祖细胞增殖中起主要作用，并负面影响其向血液的迁移。此外，CCR2与其配体（CCL2/12/13）的相互作用对于髓系细胞从骨髓输出至关重要，并显著改变其在外周血和脾脏中的数量。因此，LmWT感染与LmCen?/?感染之间CCR1/CCR2的差异表明，与LmWT感染相比，LmCen?/?疫苗接种过程中髓系细胞群体可能受到影响。与利杜曼氏虫模型不同，大棘曼氏虫的紧急造血过程尚缺乏直接的机制图谱，因此许多机制性观点来源于内脏利什曼病（VL）模型。在利杜曼氏虫感染中，基质巨噬细胞感染通过GM-CSF和TNF-α增强了对髓系造血的支撑，为理解该感染如何重塑骨髓龛位提供了模板。在高度易感的BALB/c小鼠中，大棘曼氏虫的全身性播散在讨论"安全靶点"和髓系动态改变时与VL相提并论（Bogdan 2020）。如果发生播散，相同的驱动因素类别（IL-3/Th2偏移；GM-CSF/TNF；脾脏微环境重塑）均可作为触发紧急髓系造血的合理途径；然而，鲜有研究在大棘曼氏虫特异性研究中对造血干细胞/祖细胞进行直接追踪。在标准的愈合型皮肤大棘曼氏虫感染模型中（如C57BL/6小鼠），仍存在一些关键的知识空白，包括对造血干细胞/HSPC激活状态的定量分析、谱系偏向性（髓系偏移）、脾脏-肝脏髓外造血读出指标，以及具有因果映射关系的细胞因子驱动因素（G-CSF/GM-CSF/IL-1/IL-6与IL-3）。许多大棘曼氏虫研究测量的是病灶/淋巴结的髓系细胞浸润/表型，而非上游骨髓/脾脏祖细胞动态。因此，我们的研究代表了对髓系造血过程及产物的系统性追踪。更重要的是，我们观察到与LmCen?/?感染小鼠相比，LmWT小鼠的单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞中甘精蛋白受体Sort1的表达显著降低。甘精蛋白是一种参与炎症和髓系分化的多功能蛋白。特别是，此前的研究表明，甘精蛋白在稳态和紧急髓系造血期间中性粒细胞和巨噬细胞正常分化所必需。近期在大棘曼氏虫感染中的研究证实，感染诱导的可溶性介质（如血小板来源的DKK1）可以重塑中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞程序，证明早期固有信号足以重新编程下游髓系免疫。在此背景下，LmCen?/?接种后骨髓中甘精蛋白-SORT1通讯的富集，伴随着单核细胞/中性粒细胞/巨噬细胞产量的增加以及单核细胞抗寄生虫活性的增强，支持了我们的观点：甘精蛋白信号可能功能性参与疫苗相关的髓系造血，而不仅仅是其标记。LmWT与LmCen?/?之间骨髓整体组成大体相似，但两者之间的谱系偏向性出现分歧——LmCen?/?倾向于髓系造血，而LmWT倾向于巨核细胞造血，甘精蛋白-SORT1通路是两者之间的一个区分路径。因此，LmCen?/?介导的造血偏移可能是由甘精蛋白-Sort1驱动，而非寄生虫负荷的功能结果。可以合理推断，与DKK1类似，在LmWT和LmCen?/?感染骨髓中观察到的早期固有通讯可以通过髓系中间体决定后续适应性免疫结局。因此，LmWT组中甘精蛋白受体Sort1的下调可能导致髓系造血失衡并抑制其活性。未来计划利用基因敲除小鼠模型来探讨这一问题。分子和细胞标志物的差异转化为显著不同的谱系输出。在整个感染过程中，LmCen?/?小鼠骨髓中髓系细胞显著扩增，如中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞，且均相对于 na?ve 水平发生显著变化。LmCen?/?感染导致巨核细胞数量随时间显著减少，这一变化在LmWT组中未观察到。这些发现提示LmCen?/?疫苗接种倾向于髓系造血，而降低了巨核细胞造血的优先级。MPP分析支持这些观察结果。LmCen?/?疫苗接种小鼠中MPP3群体增加，该群体定向于髓系谱系，产生中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞；而LmWT感染小鼠则偏向MPP2，该群体是巨核细胞和红细胞群体的祖细胞。这些差异输出反映了感染和炎症可重塑造血干细胞分化路径的已知现象。两组中LT-HSCs的细胞扩增表明，无论寄生虫类型如何，紧急造血均被激活，但下游谱系命运决定在疫苗接种与毒力感染之间存在差异。不仅是数量，骨髓髓系细胞的转录特征也反映了其功能差异。LmCen?/?小鼠的单核细胞表达更高水平的Adgre1（F4/80）、Ccr2和Ly6c1，这些是经典/炎症性单核细胞的标志物。此外，LmCen?/?组中Adgre1和Ccr2的较高表达反映了单核细胞来源巨噬细胞频率的升高，可能来自炎症性单核细胞。CCR2+、Ly6Ch?单核细胞是已知的炎症亚群，在感染时受CCL2信号驱动从骨髓输出，这进一步提示LmCen?/?诱导经典单核细胞的动员。中性粒细胞同样表现出转录差异。Ccr2在LmCen?/?中性粒细胞中上调，而Ly6c在LmWT细胞中更高。尽管两种分子均与炎症性中性粒细胞相关，但CCR2是中性粒细胞向感染部位迁移所必需的。这些基因表达模式提示，LmCen?/?疫苗接种使骨髓固有细胞向更具炎症性和迁移能力的表型预适应。这种功能性预适应在体外杀伤实验中得到了体现：来自LmCen?/?疫苗接种小鼠的骨髓来源单核细胞在攻毒后能够比na?ve单核细胞更有效地杀灭毒力大棘曼氏虫寄生虫。这种增强的微生物杀伤能力与"训练性免疫"现象类似，即造血干细胞或祖细胞在微生物刺激后发生表观遗传重编程，从而引发更强的免疫应答。尽管疫苗接种后训练性免疫的诱导尚未被正式证实，但我们的数据与以下观点一致：到达骨髓的寄生虫诱导固有细胞功能发生长期变化，从而增强其抗寄生虫应答。有趣的是，Ferreira等人证明，即使没有骨髓直接感染，大棘曼氏虫的持续性皮肤株也能在骨髓中诱导髓系偏向的HSPCs。在我们的研究中，HSCs中寄生虫的存在提示骨髓直接感染可能对造血重塑有贡献。在LmWT和LmCen?/?感染中骨髓中检测到数量相当的寄生虫感染宿主细胞，这一观察表明转录活性的差异可能归因于寄生虫株系而非寄生虫负荷。无论哪种情况，骨髓龛位都发生了功能性改变，在LmCen?/?感染中将HSC命运偏向髓系造血，证实大棘曼氏虫寄生虫即使以低频率进入骨髓，也足以触发并塑造这些紧急通路。总之，疫苗与毒力寄生虫之间观察到的这些分歧模式展示了活减毒疫苗如何深刻地重编程宿主造血系统，增强髓系细胞的产生和功能，从而改善免疫应答。这些效应可在转录组水平（趋化因子和甘精蛋白通路改变）和细胞群体频率上得以体现。骨髓中的这种免疫印记可能有助于解释LmCen?/?预防性疫苗接种如何赋予针对利什曼原虫感染的持久免疫力。研究局限性我们尚未正式证明甘精蛋白信号在髓系造血中的作用。我们未进行过继转移实验以检验训练性免疫在LmCen?/?免疫中的作用。资源可用性主要联系人如需进一步信息和资源及试剂，请联系并可通过主要联系人Sreenivas Gannavaram（[e-mail]）获取。材料可用性本研究未产生新的独特试剂。数据和代码可用性原始及处理的单细胞RNA测序数据集可通过https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE346567获取。本研究使用的代码作为补充信息提供。重新分析本文报告数据所需的任何额外信息可应要求从主要联系人处获取。致谢本研究由FDA内部资金资助H.L.N.，以及由全球健康创新技术基金资助A.R.S.（GHIT 2020-0134）。我们感谢OSUCCC基因组学共享资源中心的Pearlly Yan博士提供的技术支持。作者贡献概念设计，S.G.、T.P.-F.；方法学，S.G.、T.P.-F.和S.K.；调查研究，N.A.、L.K.、H.M.、N.T.、A.M.、M.B.、Su.K.、S.K.、T.P.-F.、E.S.、N.A.和S.G.；原稿撰写，T.P.-F.、N.A.和S.G.；审阅与编辑，T.P.-F.、A.R.S.、H.L.N.和S.G.；可视化，S.G.、S.K.和T.P.-F.；监督，H.L.N.和S.G.。利益声明我们的贡献属于非正式交流，代表我们自己的最佳判断。这些评论不约束也不涉及FDA。本文反映了作者的观点，不应被解释为FDA的观点或政策。美国FDA持有LmCen?/?疫苗株的美国专利第12,653,875号。FDA目前是两项美国专利的共同所有人，这些专利声称涉及Centrin基因缺失的减毒利什曼原虫种（US 7,887,812和US 8,877,213）。STAR★方法关键资源表试剂或资源|来源|标识符抗体|cKit BV421|Biolegend|Cat.No: 135124; Lot: ACK2; RRID: AB_2562237|Ly6C Pacific Blue|Biolegend|Cat.No: 128014; Lot: HK1.4; RRID: AB_1732079|CD48 BV510|Biolegend|Cat.No: 103443; Lot: HM48-1; RRID: AB_2650826|Ly6G BV570|Biolegend|Cat.No: 127629; Lot: 1A8; RRID: AB_10899738|CD11b BV785|Biolegend|Cat.No: 101237; Lot: M1/70; RRID: AB_11126744|CD150 BV650|Biolegend|Cat.No: 115931; Lot: TC15-12F12.2; RRID: AB_2562402|FITC DUMP通道 CD5|Biolegend|Cat.No: 100606; Lot: 53–7.3; RRID: AB_312671|FITC DUMP通道 CD3|Biolegend|Cat.No: 100306; Lot: 145-2C11; RRID: AB_312735|FITC DUMP通道 Ter-119|Biolegend|Cat.No: 116206; Lot: Ter119; RRID: AB_313707|FITC DUMP通道 CD-19|Biolegend|Cat.No: 152404; Lot: 1D3/CD19; RRID: AB_2629813|F4/80 PerCP|Biolegend|Cat.No: 123126; Lot: BM8; RRID: AB_893483|CD34 PE|Biolegend|Cat.No: 152204; Lot: SA376A4; RRID: AB_2629648|CXCR4 PE Dazzle|Biolegend|Cat.No: 146514; Lot: L276F12; RRID: AB_2563683|CD41 PE-Cy7|Biolegend|Cat.No: 133916; Lot: MWReg30; RRID: AB_11124102|CD200R3 APC|Biolegend|Cat.No: 142208; Lot: Ba13; RRID: AB_2561660|Sca-1 AF647|Biolegend|Cat.No: 108118; 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将股骨骨骺切出，并用10毫升冰冷的含细胞培养基冲洗（cRPMI：RPMI-1640培养基（货号：11-875-093；Gibco, Thermo Fisher, 美国纽约州大岛）中加入10%胎牛血清（货号：97068-085；Avantor Seradigm, 爱尔兰都柏林巴利科林）和1%青霉素-链霉素（货号：15140-122；Gibco, Thermo Fisher））。将冲洗得到的骨髓收集至15毫升试管中，在4°C下以1500转/分离心5分钟进行沉淀。使用TheraPEAK ACK裂解缓冲液（1倍浓度）（货号：BP10-548E；Lonza Bioscience）对沉淀进行红细胞裂解，在室温下处理3分钟。随后加入7毫升冰预冷的PBS终止反应。接着使用Cellometer细胞计数仪（Nexcelom Bioscience）进行细胞计数。最后，对细胞进行计数，并进一步用于寄生虫检测和流式细胞术细胞表型分析。

用于单细胞RNA测序的细胞制备：使用MACs单核细胞分离柱（130-100-629, Miltenyi）富集单核细胞和前体细胞群。最后对细胞进行计数，并进一步用于寄生虫检测、细胞表型分析或利什曼原虫杀伤实验。

文库制备与单细胞RNA测序：使用Chromium（10x Genomics）仪器进行单细胞RNA测序。使用Cellometer细胞计数仪对单细胞悬浮液中的单核细胞富集骨髓细胞进行计数，并使用ViaStain AOPI染色溶液（CS2-0106）测量细胞活力（活力：约100%），总细胞数为1×10?。按照制造商标准方案，使用10x Genomics Chromium Controller和Next GEM单细胞3'试剂盒v3.1（双索引）（PN-1000269；10x Genomics, 美国加利福尼亚州普莱森顿）处理细胞。将1×10?个细胞/样本和单细胞试剂装载至Chromium Next GEM芯片G单细胞试剂盒（PN-100130, 10x Genomics），并置于Chromium Next GEM芯片G（PN-2000177；10x Genomics）上，以产生GEM（凝胶珠-乳液）条形码标记。为生成GEM的微反应，将芯片装载至Chromium控制器上，目标是捕获10,000个细胞用于cDNA扩增、文库制备和测序。通过Chromium Next GEM芯片G单细胞试剂盒（PN-100130, 10x Genomics）完成cDNA扩增后，使用Agilent 2100生物分析仪配合高灵敏度DNA检测试剂盒评估cDNA质量，四个样本均通过了此质量控制步骤。

为制备最终文库，对扩增后的cDNA进行酶切片段化，并使用SPRIselect磁珠（Beckman Coulter）和文库构建试剂盒（1000196）进行片段大小选择。在最终步骤中，通过双索引试剂盒TT套装A（PN-3000431；10x Genomics）将样本连接至其对应的区分性索引。使用Agilent 2100生物分析仪配合高灵敏度DNA检测试剂盒评估最终文库质量，四个样本均通过了质控步骤。随后在Illumina NovaSeq 6000测序仪上进行测序，目标为每个细胞超过15,000条 reads（即双端 reads），LmWT i.d、LmCen?/? i.d.、LmWT i.v.和LmCen?/? i.v.样本的平均每文库深度分别为33,994、31,917、23,821和20,869 reads/细胞。

单细胞RNA测序文库自定义参考基因组的构建：为进行单细胞分析，将小鼠（基因组组装版本mm39）的基因组序列和.gtf文件分别与利什曼原虫（L. donovanii，简称L. don）和杜氏利什曼原虫（L. major，简称L. m）的对应文件合并，共创建两个自定义参考基因组。在每个自定义参考基因组中，将利什曼原虫的注释信息追加至小鼠注释文件的末尾。然后将合并的基因组和注释自定义参考基因组通过cellranger mkgtf和cellranger mkref（v7.0.1）处理，使用默认参数生成适当的基因组索引文件。我们将所有单细胞RNA测序文库与两个自定义参考基因组进行比对，发现在所有样本中，比对至mm39 + L. don自定义参考的reads数量均多于比对至mm39 + L. m的reads数量。这最可能是因为L. don最新参考基因组是同时使用最新的长读长技术和短读长测序方法构建的。因此，我们选择使用mm39 + L. don自定义参考基因组来展示本手稿中的所有结果。

单细胞RNA测序reads处理：使用cellranger mkfastq（v7.0.1）默认参数进行碱基识别。使用cellranger count（v7.0.1）分别处理每个样本的测序reads，比对至宿主/寄生虫合并基因组及对应的注释文件（mm39 + L. don，理由见上文STAR Methods部分所述）。对cellranger count生成的比对文件（.bam文件）使用samtools（v1.3.1）进一步处理，生成宿主和寄生虫特异性的指标，包括估算的细胞数量、每个细胞的中位基因数、检测到的总基因数和每个细胞的中位UMI计数。所有下游步骤中使用的L. don比对reads均确认为唯一比对至L. don参考基因组而非宿主mm39基因组。

单细胞RNA测序数据分析：由cellranger count产生的计数矩阵使用R包Seurat（v4.4）进行处理。我们过滤掉UMI计数过低、表达基因极少或线粒体基因负荷过高（提示为死亡/濒死细胞）的细胞。表达L. don特征计数≥1的细胞被视为受感染细胞，表达L. don特征计数为0的细胞被视为未感染细胞。随后使用Seurat的SCTransform特异性整合流程对样本进行整合。在基于PCA降维空间的K近邻图（KNN）上应用聚类，然后使用Seurat（v4.4）中的Louvain算法对细胞进行聚类。使用统一流形逼近与投影（UMAP）降维技术将细胞投影到二维空间。通过手动结合以下数据库对计算预测的簇进行生物细胞类型注释：CellMarker、CellMarker 2.0、panglaoDB、czscience。使用Seurat包（v4.4）中的Wilcoxon检验识别每个群体与其余细胞之间显著差异表达的基因，检测各群体的基因簇标记物，仅纳入在任一组中至少10%细胞中表达的基因。

细胞通讯网络（CCN）分析：为探究所鉴定细胞类型之间的细胞通讯模式，我们使用了CellChat R包。我们重点关注由数千种配体-受体组合构成的分泌信号通讯数据库，该数据库专为单细胞RNA测序数据集定制。我们计算了所有样本中每种配体-受体对的通讯概率，并通过对聚合数据集中未检测到某种配体-受体通讯的样本填补0通讯概率来协调数据集（但该配体-受体对在另一样本中的通讯概率>0%）。本研究观察到的每条不同网络/通路的每种配体-受体相互作用的通讯概率取平均值。

流式细胞术检测寄生虫：将2×10?骨髓单细胞悬浮细胞在37°C下与含100 μg/ml博来霉素的完全RPMI（10% FBS，1%青霉素-链霉素）共同孵育过夜（18小时）。博来霉素用于增加mCherry的寄生虫产量，因为荧光蛋白的基因表达与用于克隆选择的抗生素抗性基因相关联。使用Live Dead Aqua（L34957 Thermofisher）对2×10?个细胞进行20分钟室温染色，然后用PBS洗涤。随后在4°C下用anti-CD11b BV605（Biolegend, 货号：101237）染色30分钟。用PBS洗涤后，使用Cytek Aurora流式细胞仪进行分析。通过其mCherry表达来识别受感染细胞。

流式细胞术细胞表型分析：为表征骨髓中的细胞景观，按照上述方法制备天真的、LmWT感染和LmCen?/?感染小鼠的细胞悬浮液。使用Live Dead Aqua对死亡细胞进行染色。随后使用以下抗体（均购自Biolegend）对细胞进行染色：anti-c-Kit BV421、anti-Ly6C Pacific Blue、anti-CD48 BV510、anti-CD150 BV650、anti-CD11b BV758、anti Ly6g BV570、anti-F4/80 PerCP、anti-CD34 PE、anti-CXCR4 Pe Dazzle594、anti-CD41 PeCy7、anti-CD200R3 APC、anti-Sca-1 Alexa Fluor 647、anti-CD45 Alexa Fluor 700、anti-16/32 APC-Cy7以及FITC标记的谱系细胞鸡尾酒抗体（包括anti：Ter-119、CD19、CD45R、CD5和CD3）（表S1）。使用Cytek Aurora流式细胞仪分析细胞，数据使用Flow Jo Version 10.10.0（BD Biosciences）进行分析。

L. major WT寄生虫与骨髓分离的单核细胞共培养：按照上述方法从感染（LmWT或LmCen?/?）和天真小鼠的骨髓中获取富集单核细胞的单细胞悬浮液。然后，将1×10?个单核细胞在白色底96孔板中、使用完全RPMI并在含1×10?个纳米荧光素酶表达型L. major（LmWTnLuc）的条件下培养。共培养18小时后，在室温下以1500转/分离心5分钟洗涤细胞。收集上清液用于进一步的细胞因子分析和一氧化氮测定。将细胞沉淀重悬于100 μl完全无酚红DMEM中。加入100 μl按照说明书制备的Nano-luciferase试剂盒工作液（Promega, 货号：N1610）。在室温下于轨道摇床（50 rpm）上孵育3分钟后，使用Spectramax M5仪器配合Softmax Pro软件读取所有波长，积分时间1000毫秒。

量化与统计分析：使用GraphPad Prism Version 10对流式细胞术数据进行Mann-Whitney统计分析。* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001。每个实验均从每组（n=5-8）分离的骨髓中重复进行两次。

补充信息（2）：下载全部PDF（2.30 MB）：文档S1，图S1–S6和表S1；存档（10.12 KB）：数据S1，研究中使用的代码。