用于牛双芽巴贝斯虫感染快速诊断的RPA-CRISPR/Cas12a分子检测方法的开发与评价

《Acta Tropica》：Development and Evaluation of an RPA-CRISPR/Cas12a Molecular Assay for Rapid Diagnosis of Theileria annulata Infection in Bovines

　　

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  开发了一种快速的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法用于T. annulata检测。
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  该检测方法靶向多拷贝线粒体cytb基因，以提高灵敏度。
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  该检测方法可在50分钟内完成，检测限约为~10拷贝/反应。
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  未观察到与主要牛血液寄生虫或牛DNA的交叉反应。
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  现场评估显示该方法具有高诊断准确性，具有即时检测应用的潜力。

引言

热带泰勒虫病（TT）由顶复门原生动物Theileria annulata引起，是牛的一种主要蜱传播疾病，尤其影响杂交牛和外来品种牛。该寄生虫通过多宿主硬蜱Hyalomma anatolicum进行跨龄传播，广泛流行于南欧、北非、中东、印度次大陆、俄罗斯东部和中国南方（Jabbar 等人，2015年；Abdallah 等人，2017年；OIE，2018年）。临床上，热带泰勒虫病的特征包括发热、淋巴结肿大、脾肿大、贫血、呼吸窘迫、胃肠紊乱，严重时可致死（Mohmad 等人，2022年）。由于其高发病率、死亡率及相关生产损失，热带泰勒虫病具有重大的经济意义，全球近2.5亿头牛面临风险，仅印度就有约3900万头杂交牛易感（Bishop 等人，2004年；Kolte 等人，2017年）。在印度，该病估计每年造成约12.95亿美元损失（Narladkar，2018年）。康复动物通常终身携带病原并作为进一步的蜱传播媒介储库（Bishop 等人，2004年）。由于缺乏高效的治疗方案和可持续的媒介控制策略，亚临床感染和携带状态在印度等发展中国家仍然普遍存在，给畜牧业造成了巨大负担。

准确和早期诊断对于热带泰勒虫病的有效管理和控制至关重要。传统的诊断方法，如吉姆萨染色血涂片检查，灵敏度低，通常不足以检测无症状携带动物中的血液寄生虫，因为其虫血症水平低且波动（Chauhan 等人，2015年；Happi 等人，2020年）。此外，在印度流行病学背景下，T. annulata是牛泰勒虫病的主要原因，而T. orientalis和Theileria sp. Yokoyama等物种也在该国的不同地区有报告。多种Theileria物种在印度的共存强调了在选择适当诊断方法时考虑地区物种多样性的重要性。尽管吉姆萨染色血涂片显微镜检查广泛用于检测红细胞内梨形虫，但仅凭形态学特征可靠地区分Theileria物种仍然具有挑战性，因为形态学特征存在重叠（Liu 等人，2010年）。几种传统的血清学诊断方法，包括免疫荧光试验（IFT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和补体结合试验（CFT），常规用于泰勒虫病的监测和 surveillance（Ros-García 等人，2012年；Salih 等人，2015年）。然而，这些检测方法主要检测宿主抗体，这些抗体可能在寄生虫清除后仍持续存在于循环中。因此，血清学方法无法可靠地区分活动性感染和既往感染，可能无法识别抗体滴度低的无症状携带动物。相比之下，分子诊断方法通过直接检测寄生虫核酸提供了更高的灵敏度和特异性。常规聚合酶链反应（PCR）和定量实时PCR（qPCR）等技术显著改善了T. annulata的诊断，特别是在虫血症水平低的亚临床和携带感染中，也有助于在种和亚种水平上区分感染（Mans 等人，2015年）。然而，这些分子方法需要复杂的实验室基础设施、昂贵的设备和经过培训的人员，这限制了其在现场条件下的适用性（Ndao，2009年；Bilgic 等人，2013年）。

为了克服传统和基于PCR的诊断方法的局限性，新型基于CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）的检测平台已成为快速灵敏诊断的有前景的替代方案（Li 等人，2019年）。这些系统通常与CRISPR相关（Cas）蛋白如Cas12和Cas13偶联，能够实现目标核酸序列的高度特异性识别，并通过附带切割活性产生可检测的信号。基于CRISPR的检测方法具有多种优势，包括与qPCR相当的高灵敏度、快速周转时间、最少设备需求和即时检测应用的潜力。与等温扩增技术结合后，这些平台可以进一步增强检测效率，而无需热循环（Bai 等人，2019年；Chen 等人，2020年；Li 等人，2021年）。重要的是，基于CRISPR的诊断方法在检测低虫血症和无症状携带状态方面已显示出相当大的潜力，使其特别适合T. annulata（Feng 等人，2025年）和其他血液寄生虫（Muriuki 等人，2024b；Sutipatanasomboon 等人，2024年；Muriuki 等人，2024a；Paenkaew 等人，2024年）以及其他病原体（Ma 等人，2024年；Zhang 等人，2024年；Ren 等人，2024年；Zhang 等人，2025年；Kim 等人，2026年）的现场监测和早期诊断。因此，这些新兴技术代表了向开发快速、准确和可部署的诊断工具以实现热带泰勒虫病更好控制的重要进展。

在此背景下，本研究旨在开发、优化和评估一种针对T. annulata细胞色素b基因的新型RPA-CRISPR/Cas12a诊断检测方法。该检测方法旨在实现快速（50分钟内）、便携和高特异性检测，从而为流行区和资源受限地区提供了一种有前景的可现场部署的诊断工具。

章节摘要

样本采集

本研究利用ICAR-印度兽医学研究所CADRAD寄生虫学实验室储存库中可用的50份存档DNA样本，包括25份真阳性和25份真阴性样本，用于检测方法的开发。真阳性样本来自在受控实验室条件下感染T. annulata的小牛。通过吉姆萨染色血涂片的显微镜下梨形虫检测确认感染。

RPA和CRISPR/Cas12a检测方法优化

为实现最佳检测性能，RPA扩增和CRISPR/Cas12a检测步骤被独立优化。所开发的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的整体工作流程如图1所示。在不同的孵育温度和反应时间下评估了RPA反应，以确定产生最有效扩增的条件。如图4A和B所示，T. annulata cytb特异性RPA引物成功扩增了目标序列

讨论

热带泰勒虫病（TT），由蜱传播的血液原虫Theileria annulata引起，仍然是影响热带和亚热带地区（包括印度）牛群的最具有经济意义的疾病之一，印度有数百万头杂交牛易感感染（Kolte 等人，2017年）。早期和准确诊断对于及时进行治疗干预、有效疾病管理和中断寄生虫传播至关重要。尽管显微镜检查、血清学

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伦理考量

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资金来源

本研究由ICAR项目AINP-CEDA提供的资助支持。

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利益冲突声明

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