凝聚素的上调会诱导肠道干细胞的衰老，进而引发细胞死亡并增加肠道通透性

《iScience》：Condensin upregulation induces intestinal stem cell senescence, driving cell death and increased intestinal permeability

　　亮点
- 患有克罗恩病（CD）的患者的肠上皮细胞（IECs）表现出condensin表达增加
- 在体内，dCAPD3的过表达会导致衰老并引发细胞死亡
- 由dCAPD3介导的干细胞和邻近细胞的死亡会增加肠道通透性
- CD患者干细胞中condensin和衰老相关基因的表达增加

摘要
肠道干细胞的维持确保了不断更新的肠道屏障的完整性，促进修复，并防止底层组织的免疫细胞激活。肠道屏障缺陷会促进克罗恩病（CD）的发展，这是一种炎症性肠病（IBD）。我们发现，基因组组织复合体condensins的亚基在CD患者的肠上皮细胞中的表达上调。通过使用培养的肠上皮细胞系和果蝇（Drosophila melanogaster）的体内模型，我们发现condensin蛋白的过表达会重新排列异染色质并诱导肠干细胞的衰老，从而导致干细胞和非干细胞的死亡。在果蝇中，这会增加肠道通透性。这些发现表明，限制condensin的表达可以维持肠干细胞的稳态，为未来研究condensins和衰老干细胞在CD及其他涉及肠道屏障功能障碍的疾病中的病理作用提供了支持。

引言
肠上皮细胞（IECs）形成了物理和化学屏障，将肠道微生物和毒素与黏膜中的免疫细胞分隔开来。位于肠隐窝底部的肠干细胞（ISCs）对于维持上皮细胞的更新至关重要，这是屏障介导的保护的关键方面。最近的研究表明，肠隐窝中的其他几种细胞类型在受损后也可以分化为干细胞。肠道上皮屏障的损伤和/或功能障碍被认为与多种疾病的发病机制和病理过程有关，包括炎症性肠病（IBD）。克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）是两种主要的IBD形式，其特征是胃肠道（GI）道的反复炎症。炎症通常仅限于UC患者的结肠和直肠，而在CD患者中则可能发生在整个胃肠道中，其中克罗恩回肠炎是最常见的CD类型。目前对IBD发展和进展的病因和分子机制尚未完全了解，许多因素已被证实与该病有关，包括遗传学、表观遗传学、免疫失调、微生物组和环境等因素。UC和CD的一个共同特征是肠道屏障功能的丧失。因此，识别扰乱IEC稳态并导致肠道上皮屏障损伤的机制将揭示新的治疗靶点，以恢复IEC的稳态并减轻CD患者的慢性炎症。

结论
Condensins是染色体结构维持复合体（SMC）家族中的多亚基成员。它们调节多种重要的细胞功能，包括染色体组织、逆转录转座子表达和活性的抑制、基因表达、线粒体功能以及先天免疫反应的激活。在真核细胞中存在两种condensin复合体：condensin I和condensin II。在CD患者的细胞中观察到condensin蛋白表达水平升高，然而，尚未确定condensins在促进CD发病机制中的直接作用。在这项研究中，我们发现成年和儿童CD患者的回肠上皮细胞中的几种condensin蛋白表达上调。为了功能上探索上调的condensin蛋白对肠上皮的影响，我们在哺乳动物IEC系中过表达了condensin II亚基NCAPD3。NCAPD3的过表达导致了异染色质的全局变化，并出现了与衰老相关的异染色质聚焦点（SAHFs）。这些细胞中NCAPD3的过表达还通过自主和非自主机制增加了衰老和细胞死亡。令人兴奋的是，在果蝇肠道的干细胞和前体细胞中过表达NCAPD3的同源物dCAPD3也诱导了异染色质的重排和衰老，从而可以在体内评估这些细胞变化对肠道上皮屏障的影响。有趣的是，dCAPD3介导的ISC衰老不仅促进了ISC的死亡，还促进了非干细胞的死亡，从而增加了肠道通透性。总体而言，这些结果揭示了condensin介导的衰老及其随后的细胞死亡可能是果蝇中肠道上皮屏障功能障碍的潜在原因，并支持在CD患者组织和类器官模型中进一步研究这一机制。

分析
对已建立的bulk-RNA测序（RNA-seq）队列和少量组织切片的免疫组化染色分析表明，CD肠组织中的condensin I亚基NCAPD2显著上调。为了进一步研究这一点，我们调查了NCAPD2是否仅在CD中上调，或者这是许多condensin亚基的共同现象。为了确定其他condensin I和II亚基在CD患者中的表达是否发生改变，我们重新分析了包含来自成人（图1B）和儿童（图1C）CD患者及NI患者的小肠和末端回肠（TI）分离的IECs和干细胞的已发表的单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据集。成人CD患者的回肠上皮细胞中NCAPD2和NCAPD3的转录本均显著上调（图1B）。有趣的是，在儿童CD患者中，除了NCAPD3和NCAPD2外，还有三种condensin亚基SMC2、SMC4和NCAPG2也上调（图1C）。为了验证condensin蛋白也上调，我们从CD患者的切除回肠组织中分离出肠上皮细胞（表S1），并通过免疫印迹检测NCAPD3蛋白（如图1A中的condensin图所示）。我们选择关注NCAPD3，因为它是在儿童和成人数据集中都上调的两个condensin基因之一。结果显示，与NI患者相比，NCAPD3蛋白显著增加（图1D和1E）。这一发现仅限于回肠IECs，因为对结肠IECs的NCAPD3表达分析显示CD和NI样本之间的水平相似（图S1A–S1C）。为了确定NCAPD3的上调是在转录水平还是转录后水平发生的，我们通过定量逆转录PCR（RT-qPCR）测量了回肠IECs中的NCAPD3转录本。结果表明，CD样本中的NCAPD3转录本有增加的趋势，但这种变化没有达到统计学显著性（图1F）。

dCAPD3在Drosophila肠道干细胞和前体细胞中的过表达
为了研究dCAPD3在Drosophila中的效应，我们在Drosophila肠道的干细胞和前体细胞中过表达了NCAPD3的同源物dCAPD3。dCAPD3的过表达导致了异染色质的重排和衰老，从而允许评估这些细胞变化对肠道上皮屏障的影响。令人惊讶的是，dCAPD3介导的ISC衰老不仅促进了ISC的死亡，还促进了非干细胞的死亡，从而增加了肠道通透性。总体而言，这些结果揭示了condensin介导的衰老及其随后的细胞死亡可能是Drosophila中肠道上皮屏障功能障碍的潜在原因，并支持在人类患者组织和CD类器官模型中进一步研究这一机制。

结论
- 克罗恩病患者的回肠上皮细胞中condensin亚基表达升高
- 对已建立的bulk-RNA测序（RNA-seq）队列和少量组织切片的免疫组化染色分析表明，CD肠组织中的condensin I亚基NCAPD2显著上调。为了进一步研究这一点，我们调查了NCAPD2是否仅在CD中上调，还是许多condensin亚基的普遍现象。为了确定其他condensin I和II亚基在CD患者中的表达是否发生改变，我们重新分析了已发表的单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据集，这些数据集包括了来自成人（图1B）和儿童（图1C）CD患者及NI患者的小肠和末端回肠（TI）的IECs和干细胞。成人CD患者的回肠上皮细胞中NCAPD2和NCAPD3的转录本均显著上调（图1B）。有趣的是，在儿童CD患者中，除了NCAPD3和NCAPD2外，还有三种condensin亚基SMC2、SMC4和NCAPG2也上调（图1C）。为了验证condensin蛋白也上调，我们从CD患者的切除回肠组织中分离出肠上皮细胞（表S1），并通过免疫印迹检测NCAPD3蛋白（如图1A中的condensin图所示）。我们选择关注NCAPD3，因为它是在儿童和成人数据集中都上调的两个condensin基因之一。结果显示，与NI患者相比，NCAPD3蛋白显著增加（图1D和1E）。这一发现仅限于回肠IECs，因为对结肠IECs的NCAPD3表达分析显示CD和NI样本之间的水平相似（图S1A–S1C）。为了确定NCAPD3的上调是发生在转录水平还是转录后水平，我们通过定量逆转录PCR（RT-qPCR）测量了回肠IECs中的NCAPD3转录本。结果表明，CD样本中的NCAPD3转录本有增加的趋势，但这种变化没有达到统计学显著性（图1F）。

dCAPD3在永生化哺乳动物肠上皮细胞中重组异染色质
为了研究提高IECs中NCAPD3蛋白水平对下游分子的影响，HT29结肠腺癌细胞短暂转染了表达mCherry-NCAPD3的构建物或仅表达mCherry的载体。免疫印迹分析证实，与mCherry载体对照细胞相比，mCherry-NCAPD3转染细胞中的NCAPD3蛋白增加了4倍以上（图2A）。进行了免疫荧光分析，并用DAPI染色DNA。虽然在mCherry转染细胞中未观察到核形态的明显变化（图2B），但mCherry-NCAPD3的过表达导致了DAPI密集染色质聚焦点的形成（图2B和2C）。之前在人类视网膜上皮细胞和成纤维细胞中过表达另一种condensin II亚基NCAPH2时也观察到了类似的聚焦点，这些聚焦点与异染色质标记H3K9me3重叠。为了确定这是否在mCherry-NCAPD3表达的HT29细胞中也成立，转染细胞被免疫染色以检测H3K9me3（图2B和2C，绿色）。DAPI染色的DNA与mCherry转染细胞中的H3K9me3阳性染色质没有紧密重叠（图2B）。然而，在mCherry-NCAPD3转染细胞中，DAPI密集的聚焦点与H3K9me3染色同时出现（图2C）。结果表明，大约一半的mCherry-NCAPD3转染细胞也表现出H3K9me3阳性聚焦点（图S2）。这些结果表明，哺乳动物IECs中NCAPD3水平的升高可以导致异染色质显著重组为H3K9me3阳性聚焦点，但这并非在所有细胞中都会发生。

NCAPD3的过表达促进了哺乳动物肠上皮细胞的衰老和细胞死亡
- 在衰老细胞中观察到了H3K9me3阳性染色质聚焦点，这些聚焦点被标记为SAHFs。值得注意的是，condensin II已被证明参与调节人肺成纤维细胞中衰老基因的表达。为了确定NCAPD3的过表达是否也会导致IECs的衰老，在HT29细胞中转染mCherry-NCAPD3或仅转染mCherry后进行了与衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）测定（图3A）。与mCherry转染细胞相比，mCherry-NCAPD3转染细胞中SA-β-gal阳性细胞的百分比随着时间的推移显著增加（图3B）。为了测试NCAPD3的过表达是否也能在原代细胞中诱导衰老，在大鼠肠上皮细胞IEC6中进行了类似的实验。mCherry-NCAPD3转染IEC6细胞后，NCAPD3水平增加了约4倍（图S3B），有趣的是，与mCherry载体转染细胞相比，未标记的胞质NCAPD3蛋白也增加了（图S3A）。随后在mCherry-NCAPD3转染的IEC6细胞中定量了SA-β-gal阳性细胞的数量，结果显示转染后72小时时SA-β-gal阳性细胞的数量增加（图3C）。进行了补充的免疫荧光分析以检测HT-29和IEC6细胞中的细胞衰老标志物p21。结果显示，与mCherry转染细胞相比，mCherry-NCAPD3转染细胞在转染后72小时时p21的水平增加（图3D–3F）。（E）p21强度水平是通过在（D）中的三个独立实验使用Volocity软件量化的。每个实验中量化的细胞数量超过400个，显示的是平均值。p值是通过进行非配对Student’s t检验确定的。****p ≤ 0.0001。误差条表示平均值的標准差。（F）在IEC6细胞中进行了与（D）和（E）中相同的实验。（G）通过RT-qPCR检测作为衰老相关分泌表型（SASP）一部分激活的基因的转录本水平，在mCherry或mCherry-NCAPD3转染的HT29细胞中。p值是通过进行非配对Student’s t检验确定的。*p ≤ 0.05，***p ≤ 0.01。误差条表示平均值的標准差。衰老细胞激活编码调节炎症信号传导、溶酶体活性和组织重塑的蛋白质的基因，这些统称为衰老相关分泌表型（SASP）。RT-qPCR分析表明mCherry-NCAPD3过表达增加了HT29细胞中许多已知SASP基因的水平（图3G）。最后，通过免疫荧光分析分析了转染后24小时的NCAPD3过表达细胞中DNA复制标志物（溴脱氧尿苷[BrdU]的水平。结果显示，与BrdU+的mCherry转染对照细胞相比，mCherry-NCAPD3转染的HT29细胞中BrdU阳性的比例显著降低（图S4A）。在IEC6细胞中进行的实验中也观察到了类似的结果（图S4B）。综合这些结果表明，NCAPD3水平的升高促进了细胞衰老，从而减少了循环中的哺乳动物IEC的数量。NCAPD3过表达后观察到的循环细胞数量减少也可能是因为细胞死亡增加。为了确定NCAPD3过表达是否也促进了细胞凋亡，我们在转染后72小时和96小时，对转染了mCherry-NCAPD3或仅转染了mCherry的细胞进行了免疫荧光分析，以检测凋亡标志物caspase 3的水平（图4A）。与转染mCherry的细胞相比，mCherry-NCAPD3转染的HT29细胞和IEC6细胞中caspase 3的水平显著增加（图4B和图4C），这表明NCAPD3水平的升高也会诱导哺乳动物IEC的细胞死亡。出乎意料的是，许多mCherry细胞也呈caspase 3阳性，这表明NCAPD3过表达可能以细胞自主和非自主的方式诱导死亡（图4A）。

图4：NCAPD3表达升高会增加哺乳动物IEC的细胞死亡

**图注说明：**
(A) 对转染了mCherry和mCherry-NCAPD3的HT29细胞进行了免疫荧光分析，以检测细胞死亡标志物caspase 3（绿色）。图像是用40倍物镜在共聚焦显微镜上拍摄的。刻度条为25微米。显示了z堆栈的最大投影。
(B) 显示了转染后72小时和96小时的三个独立实验的量化结果。每个独立实验中量化的细胞数量超过100个。
(C) （A）和（B）中描述的实验是在IEC6细胞中进行的。每个独立实验中量化的细胞数量超过70个。在（B）和（C）中，p值是通过进行非配对Student’s t检验确定的。*p ≤ 0.05，***p ≤ 0.001。误差条表示平均值的標准差。

**果蝇中NCAPD3同源物dCAPD3的过表达增加肠道通透性**
果蝇黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的中肠由于功能相似性、存在相似的肠道上皮亚型以及调节每种肠道上皮亚型稳态的相似转录程序，与人类小肠相似。在中肠中，Esg+的肠道干细胞（ISCs）不对称分裂以自我更新，并生成肠祖细胞（EB），它是肠细胞（ECs）的前体；或者生成肠内分泌前体（EEP），它将分化为肠内分泌细胞（EE）。因此，esgGAL4将在中肠的ISCs、EBs和EEPs中驱动GFP蛋白的表达（图5A）。为了确定果蝇NCAPD3同源物dCAPD3在中肠干细胞和前体细胞中的过表达是否影响整体肠道健康和功能，我们使用了esgGAL4驱动因子过度表达GFP-dCAPD3或GFP（对照）（图5B），并进行了SMURF测定来测量肠道通透性。在SMURF测定中，成年果蝇被喂食含有蓝色染料的蔗糖溶液。肠道上皮屏障完整的果蝇（非SMURF；图5C）会将染料保留在肠道内，而屏障受损的果蝇会将蓝色染料泄漏到周围组织中（SMURF；图5C）。随着果蝇年龄的增长，野生型群体中的SMURF表型会自然增加。在表达GFP的对照果蝇中也观察到了类似的现象，其肠道通透性随年龄增加（图5D）。值得注意的是，表达GFP-dCAPD3的10天大的成年果蝇中，SMURF果蝇的比例显著增加，表明dCAPD3过表达比正常成年果蝇更早地加速了肠道通透性的发生。生存测定显示，与对照组相比，dCAPD3过表达还降低了10-30天大的果蝇的存活概率（图5E）。有趣的是，对从野生型成年果蝇中切取的中肠进行RT-qPCR分析发现，无论SMURF表型状态如何，dcapd3转录本的水平都随年龄增加（图S5）。为了确定这些结果是否仅限于干细胞和前体细胞中dCAPD3的过表达，我们还使用了tkgGAL4和myo1aGAL4分别在EEs（图S6A）和ECs（图S6B）中驱动蛋白表达。tkgGAL4和myo1aGAL4驱动的dCAPD3表达导致通透性趋势增加；然而，这些结果都不显著。最后，esgGAL4驱动的condensin I亚基dCAPD2的过表达也显著增加了10天大果蝇中的SMURF比例（图S7）。综上所述，这些结果表明，果蝇中肠干细胞和前体细胞中condensin蛋白水平的升高会导致肠道屏障功能障碍，从而增加通透性。

**图5：果蝇中dCAPD3水平升高增加肠道通透性**

**图注说明：**
(A) 绘图展示了从Esg+干细胞生成肠道细胞类型的进程。Esg+肠道干细胞（ISCs）不对称分裂以自我更新，并生成肠祖细胞（EB），它是肠细胞（ECs）的前体；或者生成肠内分泌前体（EEP），它将分化为肠内分泌细胞（EEs）。因此，esgGAL4将在中肠的ISCs、EBs和EEPs中驱动GFP蛋白的表达。
(B) 通过RT-qPCR检测从表达GFP或GFP-dCAPD3的20天大的雌性果蝇中切取的中肠中的dcapd3转录本水平。每个点代表一个包含25个样本的实验。p值是通过进行非配对Student’s t检验确定的。误差条表示平均值的標准差。

**dCAPD3在中肠干细胞中的过表达影响肠道通透性**
果蝇黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的中肠由于功能相似性、类似的肠道上皮亚型以及调节每种肠道上皮亚型稳态的相似转录程序，与人类小肠相似。在中肠中，Esg+的ISCs不对称分裂以自我更新，并生成肠祖细胞（EB），它是肠细胞（ECs）的前体；或者生成肠内分泌前体（EEP），它将分化为肠内分泌细胞（EE）。esgGAL4将在中肠的ISCs、EBs和EEPs中驱动GFP蛋白的表达（图5A）。为了确定果蝇NCAPD3同源物dCAPD3在中肠干细胞和前体细胞中的过表达是否影响整体肠道健康和功能，我们使用了esgGAL4驱动因子过度表达GFP-dCAPD3或GFP（对照）（图5B），并进行了SMURF测定来测量肠道通透性。在SMURF测定中，成年果蝇被喂食含有蓝色染料的蔗糖溶液。肠道上皮屏障完整的果蝇（非SMURF；图5C）会将染料保留在肠道内，而屏障受损的果蝇会将蓝色染料泄漏到周围组织中（SMURF；图5C）。在野生型群体中，随着果蝇年龄的增长，SMURF表型也会自然增加。这在表达GFP的对照果蝇中也观察到了，其肠道通透性随年龄增加（图5D）。值得注意的是，表达GFP-dCAPD3的10天大的成年果蝇中，SMURF果蝇的比例显著增加，表明dCAPD3过表达比正常成年果蝇更早地加速了肠道通透性的发生。生存测定显示，dCAPD3过表达还降低了10-30天大果蝇的存活概率（图5E）。有趣的是，对从野生型成年果蝇中切取的中肠进行的dcapd3转录本进行RT-qPCR分析发现，无论SMURF表型状态如何，dcapd3转录本的水平都随年龄增加（图S5）。为了确定这些结果是否特异性地由干细胞和前体细胞中dCAPD3的过表达引起，我们还使用了tkgGAL4和myo1aGAL4分别在EEs（图S6A）和ECs（图S6B）中驱动蛋白表达。tkgGAL4和myo1aGAL4驱动的dCAPD3表达导致通透性趋势增加；然而，这些结果都不显著。最后，esgGAL4驱动的condensin I亚基dCAPD2的过表达也显著增加了10天大果蝇中的SMURF比例（图S7）。综上所述，这些结果表明，果蝇中肠干细胞和前体细胞中condensin蛋白水平的升高会导致肠道屏障功能障碍，从而增加通透性。

**图5：果蝇中dCAPD3水平升高增加肠道通透性**

**图注说明：**
(A) 这个示意图展示了从Esg+干细胞生成肠道细胞类型的进程。Esg+肠道干细胞（ISCs）不对称分裂以自我更新，并生成肠祖细胞（EB），它是肠细胞（ECs）的前体；或者生成肠内分泌前体（EEP），它将分化为肠内分泌细胞（EE）。因此，esgGAL4将在中肠的ISCs、EBs和EEPs中驱动GFP蛋白的表达。
(B) 通过RT-qPCR检测从表达GFP或GFP-dCAPD3的20天大的雌性果蝇中切取的中肠中的dcapd3转录本水平。每个点代表一个包含25个样本的实验。p值是通过进行非配对Student’s t检验确定的。误差条表示平均值的標准差。
(C) 和 (D) 进行了SMURF测定，以量化表达上游激活序列（UAS）-GFP或UAS-GFP-dCAPD3的果蝇中的肠道通透性缺陷。在(C)中，图像显示了被描述为“非SMURF”的成年雌性，其蓝色染料仅出现在口器和肠道上（左侧），以及被描述为“SMURF”的成年雌性，其蓝色染料遍布全身（右侧）。在(D)中，量化了1天（1天大）、10天（10天大）、20天（20天大）、30天（30天大）和50天（50天大）龄的雌性果蝇中表现出SMURF表型的比例。每个点代表一个包含25只果蝇的实验。p值是通过进行非配对Student’s t检验确定的。*p ≤ 0.05，***p ≤ 0.01，ns，不显著。误差条表示平均值的標准差。
(E) Kaplan-Meier曲线显示了表达GFP或GFP-dCAPD3的成年雌性果蝇在50天内的存活率。p值是通过进行Gehran-Breslow-Wilcoxon检验确定的。****p ≤ 0.0001。标尺：(D)顶部行的标尺为124.4 μm，(D)–(F)中其他所有图像的标尺为62.3 μm。(G) 从(D)–(F)中的实验以及从表达不同组合的UAS-GFP或UAS-GFP-dCAPD3以及UAS-mCherry dsRNA（对照）或UAS-dacapo dsRNA以敲低衰老诱导因子dacapo的成年雌性果蝇中切出的中肠进行的类似实验中，量化了GFP+、SA-β-gal+细胞的百分比。每个点代表一个中肠。p值是通过执行单因素方差分析（one-way Anova）得出的。?p ≤ 0.05，??p ≤ 0.01，???p ≤ 0.001，????p ≤ 0.0001。误差条表示平均值的标准偏差。(H) 从表达不同组合的UAS-GFP或UAS-dCAPD3以及UAS-mCherry dsRNA（对照）或UAS-dacapo dsRNA的成年10日龄雌性果蝇中，量化了表现出SMURF表型的果蝇百分比。每个点代表一个包含25只果蝇的实验。p值是通过执行单因素方差分析得出的。?p ≤ 0.05，??p ≤ 0.01。误差条表示平均值的标准偏差。

dCAPD3在果蝇肠干细胞（ISCs）中诱导的衰老导致中肠细胞死亡
为了确定dCAPD3在中肠中的过表达是否也会导致细胞死亡，进行了Apoptag检测。Apoptag检测已被用于检测果蝇组织中的凋亡细胞。使用共聚焦显微镜对10日龄雌性果蝇的中肠R2和R4区域进行了成像。虽然在表达GFP的非SMURF对照果蝇的中肠中观察到的死亡细胞非常少，但在过表达dCAPD3的非SMURF和SMURF果蝇的中肠中观察到了显著更高比例的死亡细胞（图8A–8C）。表达果蝇凋亡抑制因子dIAP1完全恢复了表现出SMURF表型的成年果蝇的比例（图8D），并完全恢复了过表达dCAPD3的中肠中的干细胞和前体细胞的死亡（图8B）。这些实验还使我们能够量化GFP-（非干细胞/前体）细胞的数量。总体而言，在我们的检测中，不同基因型的中肠中计数到的细胞核数量和GFP+细胞的百分比没有显著差异（图S8）。然而，有趣的是，dCAPD3的过表达也增加了非干细胞/前体细胞的死亡，而在干细胞/祖细胞中表达dIAP1则恢复了非干细胞/前体细胞的死亡（图8C）。综合这些结果表明，dCAPD3的过表达会导致果蝇中肠干细胞和前体细胞以及非干细胞/前体细胞的死亡，很可能导致结构缺陷（如图7C所示）、肠道屏障功能障碍和肠道通透性增加。

图8 dCAPD3在肠干细胞和前体细胞中的过表达导致干细胞/前体细胞和非干细胞/前体细胞的死亡，并增加肠道通透性
显示完整说明

图示查看器
(A) 对10日龄的成年雌性果蝇肠道进行了免疫荧光分析，以检测GFP（绿色）、凋亡细胞（apoptag+；红色）或DAPI（蓝色），以检测GFP阳性的干细胞和前体细胞与凋亡染色的共定位。实验是在表达UAS-GFP的肠道上进行的，这些肠道没有（非SMURF）表现出肠道通透性，以及在表达UAS-GFP-dCAPD3的肠道上进行的，这些肠道有（SMURF）或没有（非SMURF）表现出增加的肠道通透性。使用40倍物镜对中肠的R2和R4区域进行了成像。显示的是z堆栈的最大投影。标尺为25 μm。所示图像代表至少4个生物学重复实验的结果。
(B和C) 从(A)中的实验以及从表达不同组合的UAS-GFP或UAS-dCAPD3和UAS-dIAP1（以抑制细胞死亡）的成年雌性果蝇中切出的中肠进行的类似实验中，量化了(B) GFP+、apoptag+细胞或(C) GFP-、apoptag+细胞的百分比。每个点代表一个中肠。p值是通过执行单因素方差分析得出的。?p ≤ 0.05，??p ≤ 0.01，???p ≤ 0.001。误差条表示平均值的标准偏差。
(D) 在表达不同组合的UAS-GFP或UAS-dCAPD3和UAS-dIAP1的成年10日龄雌性果蝇中，量化了表现出SMURF表型的果蝇百分比。每个点代表一个包含25只果蝇的实验。p值是通过执行单因素方差分析得出的。?p ≤ 0.05，??p ≤ 0.01。误差条表示平均值的标准偏差。
为了确定衰老和细胞死亡是否都导致了在过表达dCAPD3的中肠中观察到的肠道通透性增加，或者其中一个是否发生在另一个之前，对同时表达果蝇凋亡抑制因子dIAP1和GFP或GFP-dCAPD3的果蝇的中肠进行了SA-β-gal检测。dIAP1的表达在两种遗传背景下都导致SA-β-gal+的干细胞和前体细胞百分比增加（图9A），这表明衰老的GFP-dCAPD3过表达的干细胞/前体细胞可能是导致细胞死亡增加的原因。为了验证这一点，对同时表达dacapo dsRNA和GFP或GFP-dCAPD3的果蝇的中肠进行了凋亡检测。结果表明，dacapo的敲低减少了衰老的干细胞/前体细胞的数量（图7G），并在过表达dCAPD3的中肠中恢复了死亡中的干细胞/前体细胞和非干细胞/前体细胞的百分比（图9B和9C）。这些结果共同表明，衰老发生在细胞死亡之前，并提出了一个模型，即升高的dCAPD3水平诱导了果蝇中肠干细胞和前体细胞的衰老，导致它们及其非干细胞/前体细胞邻居发生凋亡，从而导致肠道上皮屏障的破坏和肠道通透性的增加。

图9 冯萨林（condensin）介导的衰老在肠干细胞和前体细胞中的诱导导致细胞死亡和肠道通透性增加
显示完整说明

图示查看器
(A) 按照图7中的描述进行了SA-β-gal检测，以检测表达(A) UAS-GFP，(B) 不表现出肠道通透性的UAS-GFP-dCAPD3（非SMURF）或(C) 表现出肠道通透性的UAS-dCAPD3（SMURF）的10日龄成年雌性果蝇中肠的R2和R4区域中的衰老细胞。还在表达UAS-GFP或UAS-GFP-dCAPD3并结合凋亡抑制剂UAS-dIAP1的中肠上进行了检测，以检测GFP阳性的干细胞和前体细胞与SA-β-gal染色的共定位。使用40倍物镜对中肠进行了成像。每个点代表一个中肠。p值是通过执行单因素方差分析得出的。?p ≤ 0.05，???p ≤ 0.0001。误差条表示平均值的标准偏差。
(B和C) 从表达不同组合的UAS-GFP或UAS-dCAPD3和UAS-dIAP1（以抑制细胞死亡）的成年雌性果蝇中切出的中肠中，量化了(B) GFP+、apoptag+细胞或(C) GFP-、apoptag+细胞的百分比。每个点代表一个中肠。p值是通过执行单因素方差分析得出的。?p ≤ 0.05，??p ≤ 0.01，???p ≤ 0.001，???p ≤ 0.001，????p ≤ 0.0001。误差条表示平均值的标准偏差。
(D) 表明了 Pearson相关性，这些相关性是通过对非炎症性肠病（IBD）成年患者（左）或克罗恩病（CD）成年患者（右）的scRNAseq数据重新分析得出的，用于比较凝集素（condensin）亚单位（y轴）和衰老标志物（x轴）的表达。具有显著p值的相关性显示为绿色，而具有非显著p值的相关性显示为红色。
为了将我们在果蝇中的发现与人类肠道屏障功能障碍联系起来，我们首先进行了皮尔逊相关性分析，以确定人类凝集素亚单位的水平是否与年龄呈正相关，正如我们在野生型果蝇中观察到的那样（图S5）。我们使用了之前发布的来自分析成人 và tr? em IBD患者小肠和回肠（TI）中分离的干细胞的scRNA-seq数据集，来分析所有八种凝集素I和凝集素II亚单位的水平，以及不同年龄患者的衰老标志物CDKN1A（p21）和CDKN2A（p16）的水平。结果显示，CDKN2A随年龄显著升高，而CDKN1A的升高几乎达到显著性（p = 0.06）（图S9）。有趣的是，所有凝集素I和凝集素II亚单位的水平也与年龄显著正相关，除了NCAPH2（图S9）。接下来，我们确定了凝集素转录水平是否与NI和CD患者及成人患者的p21/CDKN1A和p16/CDKN2A相关。结果显示，在CD患者的回肠干细胞中，所有凝集素蛋白质与CDKN1A和CDKN2A均显著相关（图9D，右图）。相反，在NI患者的回肠干细胞中，只观察到NCAPH2与CDKN2A之间的一个显著相关性（图9D，左图）。这些数据共同表明，凝集素的上调在NI患者回肠干细胞中发生，并且凝集素的上调可能导致CD患者回肠干细胞的衰老。

讨论
这里呈现的数据表明，CD患者回肠上皮细胞中的凝集素亚单位转录本和蛋白质水平升高，并揭示了这种上调在哺乳动物组织培养细胞和果蝇肠道体内的潜在有害效应。在哺乳动物组织培养细胞中，凝集素II亚单位NCAPD3的上调会导致异染色质的整体重组、衰老和死亡。这些结果在果蝇中肠干细胞和前体细胞中过表达dCAPD3时也得到了再现，并且由于也观察到了非干细胞和前体细胞的死亡而得到了放大。此外，这导致中肠的形态学变化、肠道通透性增加以及年轻果蝇的存活率降低。
凝集素介导的染色质重组与细胞衰老的诱导相关
表观遗传学和染色质组织已被证明会影响肠道上皮的稳态、免疫细胞的生长和分化以及对微生物侵害的免疫反应。在IBD患者细胞和组织中观察到了表观遗传修饰因子的表达失调和特定IBD风险位点的组织结构受损。我们的结果表明，升高的NCAPD3/dCAPD3蛋白水平会导致异染色质整体重组为DAPI-密集的、H3K9me3+焦点（图2C和6）。这一现象与Yokoyama等人在人类细胞中的先前发现一致，他们表明NCAPH2的过表达也会诱导类似焦点的形成，这表明这是由凝集素蛋白过表达引起的共同表型。NCAPH2诱导的焦点被描述为SAHFs，进一步的研究表明凝集素促进了DNA环向有利于与衰老相关基因转录的区域的重组。在凝集素蛋白上调后，类似的分子机制也可能在肠干细胞（ISCs）中发生，导致衰老和SASP基因的表达，这通过凝集素蛋白与CDKN1A/CDKN2A在成人CD患者回肠干细胞中的相关性得到了证实（图9D）。这需要在未来使用从分离的患者IECs开发的组织培养和类肠细胞培养物进行的Hi-C实验中进行测试。
凝集素介导的肠干细胞衰老诱导广泛的细胞死亡
我们观察到大约50%的mCherry-NCAPD3转染的HT-29细胞中有H3K9me3阳性焦点（图S2）。如果SAHFs标记衰老细胞，那么只有50%的NCAPD3过表达细胞是衰老的。根据我们在果蝇中的结果，其他50%的细胞可能已经在经历细胞死亡。几项研究表明，衰老和凋亡可以由相同的应激因素在细胞中激活，最终结果取决于细胞特定的情况，包括年龄、细胞适应性、细胞类型以及细胞所承受的基因组损伤程度。低剂量的DNA损伤诱导应激可以导致衰老，而高剂量的DNA损伤可以导致凋亡，尽管在体内明确证明衰老驱动凋亡的证据很少。我们涉及遗传抑制凋亡和衰老的实验清楚地表明，在凝集素过表达的ISCs中，衰老发生在凋亡之前（图9）。有趣的是，在GFP和GFP-dCAPD3过表达的中肠中阻止细胞死亡后，衰老的干细胞和前体细胞的比例增加（图9A）。然而，在不阻止细胞死亡的情况下，仅在GFP-dCAPD3过表达的中肠中肠道通透性增加（图8D），这表明GFP-dCAPD3过表达的肠干细胞中有些独特的因素导致了死亡和随后的肠道屏障功能障碍。是否是由于SASP基因的上调尚不清楚。未来的研究旨在确定这些独特特性，如果这些特性在人类IBD患者中得到保守，那么这些特性将是识别可治疗途径的关键。

在果蝇和脊椎动物中，吞噬凋亡细胞的吞噬细胞并上调TNF和JNK信号通路的成员可以促进邻近细胞的死亡，这一过程称为噬细胞凋亡（phagoptosis）。此外，在果蝇和脊椎动物的发育组织中，邻近细胞的簇可以迅速发生凋亡，研究表明这是由于凋亡细胞分泌的因子造成的。未来的研究将重点关注巨噬细胞样血细胞以及TNF和JNK信号通路在凝集素过表达的果蝇肠道中诱导非自主凋亡中的潜在作用，这将有助于了解这些机制是否参与了这些果蝇中SMURF表型的产生。最后，condensin蛋白的过表达可能激活全局应激通路，导致肠通透性和细胞死亡。因此，未来的研究将包括对未折叠蛋白反应和内质网（ER）应激通路的探究，以确定这些通路是否可能是dCAPD3过表达中肠通透性增加的潜在机制。

condensin蛋白过表达对衰老和IBD发病机制的潜在影响

衰老被认为可能是IBD发病机制的一个因素。一项研究显示，在早期CD患者的肠道干细胞和前体细胞中，p16和p21的染色增加，作者指出SASP的存在可能在患者中产生显著的非细胞自主性致病效应。最近的一项研究表明，在来自CD患者的类器官（PDOs）中激活了与衰老相关的转录程序，并表现出增加的SA-β-gal染色，这种染色可以通过使用senolytic和senomorphic药物来逆转。有趣的是，能够自发发展成回肠炎的小鼠品系SAMP1/Yit最初来源于一个易衰老的品系SAMP1，该品系具有较短的寿命以及其他与早衰相关的表型。尽管在SAMP/Yit小鼠及其后续衍生的SAMP/YitFc小鼠中已经消除了缩短的寿命现象，但一些导致衰老的细胞特异性分子事件可能仍然存在，并可能促进回肠炎的发展。值得注意的是，SAMP/YitFc小鼠在3周大时就表现出增加的细胞间肠通透性，而且这种情况发生在炎症发生之前。此外，这些小鼠的回肠炎症区域表现出增加的上皮细胞死亡，这一现象可以通过使用抗TNF抗体进行治疗来缓解。未来研究通过检查SAMP1/Yit ISCs中的condensin表达和功能，将有助于建立condensin、衰老和肠通透性之间的更多体内关联。

我们的数据表明，与NI患者的IECs相比，CD患者的IECs中condensin I和II亚基的表达上调（图1）。如果condensin亚基的上调确实影响肠通透性并促进人类疾病的发病机制，那么调节condensin表达的机制可以被作为治疗靶点来改善疾病。不幸的是，目前还不是很清楚调节condensin亚基表达的机制。研究表明PLK1可以调节人类细胞中condensin II亚基NCAPH2的表达。NCAPD3的转录在前列腺癌细胞系中被雄激素受体上调，但这一点在IECs中尚未得到研究。我们的数据（图S3A）显示，在mCherry-NCAPD3转染的细胞的细胞核和细胞质中，内源性（未标记的）NCAPD3蛋白都上调，这表明NCAPD3表达可能存在自我调节机制。这需要进一步深入研究condensin蛋白自我调节其表达的能力。condensin亚基的表达还可能直接影响其他condensin亚基的稳定性，因为在某些人类细胞中，敲低一个亚基已被证明会降低其他相关亚基的水平。因此，一个condensin亚基的上调可能作为condensin复合物形成的核心，稳定复合物中的所有蛋白质，这需要在IECs中进行验证。

最后，我们的数据显示，随着果蝇年龄的增长，dCAPD3基因的表达自然增加（图S5），并且过表达可能会驱动与衰老相关的病理变化。有趣的是，我们在10天大的果蝇中观察到dCAPD3过表达的肠道具有增加的通透性，但在1天大的果蝇中没有这种现象（图5D）。通常，肠道在闭合后3-4天才会完全成熟。因此，可能在dCAPD3过表达的 middguts 中诱导通透性的机制在成熟完成之前并未完全发挥作用，这需要在未来的研究中进行验证。出乎意料的是，我们对NI患者的scRNA-seq数据的重新分析表明，除了NCAPH2之外，所有condensin亚基的表达都与年龄正相关（图S9），这与果蝇中的dCAPD3表达结果相似。随着人类年龄的增长，衰老会导致体内无菌炎症（已有综述），而衰老患者占IBD患者总数的很大比例。未来的研究如果能够确定大量健康患者或CD患者中衰老与condensin亚基表达增加之间是否存在相关性，可能会揭示关于condensin介导的衰老及其在自然衰老和疾病发病机制中对肠道功能障碍的潜在贡献的重要线索。

研究的局限性

本研究存在一些局限性。首先，在从CD患者分离的回肠上皮细胞中观察到了NCAPD3水平升高。虽然分析了男性和女性患者的样本（表S1），但由于样本数量较少，无法得出性别是否影响NCAPD3上调程度的结论。其次，目前没有容易转染/转化的人类回肠细胞系可供使用，尽管NCAPD3过表达在HT-29细胞中导致了异染色质的重组，但这些细胞是结肠腺癌细胞系，因此不适合作为这些实验的理想模型。因此，虽然我们也观察到dCAPD3过表达在果蝇middgut中驱动了异染色质的重组，但尚不清楚condensin亚基过表达是否也会在人类回肠上皮细胞中驱动异染色质的重组。第三，尽管观察到condensin水平升高会导致ISCs及其邻近细胞的死亡，并且这种死亡发生在干细胞的衰老激活之后，但细胞死亡如何“传播”到邻近细胞的精确分子机制仍不清楚。

资源可用性

如需进一步的信息和资源，请联系主要联系人Michelle Longworth（[e-mail]）。

材料可用性

本研究没有生成新的独特试剂。

数据和代码可用性

•本文分析了现有且公开可用的数据。儿童CD的scRNA数据集存储在gutcellatlas.org和ArrayExpress（E-MTAB-8901）上。成人CD的scRNA数据集存储在Single Cell Portal（SCP2959）上。访问编号也列在关键资源表中。

•本文未报告原始代码。

•如需重新分析本文报告的数据，可向主要联系人咨询以获取额外信息。

致谢

我们感谢Norbert Perrimon博士慷慨提供esg GAL4、myo1AGAL4和tkgGAL4果蝇品系。特别感谢Lerner研究所成像核心的Judith Drazba博士和Ajay Zalavadia博士在帮助我们改进各种成像技术方面提供的巨大支持。这项工作部分得到了NIH（NIGMS R01GM147138给M.S.L.）、Cure for IBD（给M.S.L.）的资助，以及NIH给MJT（NICHD F32HD114499）的资助，还得到了国防部卫生事务助理办公室通过美国陆军医学研究采购活动奖（W81XWH-19-1-0488号授予C.M.）的支持。观点、解释、结论和建议仅代表作者本人，并不一定得到NIH或国防部的认可。

作者贡献

A.K.、G.R.和M.S.L.构思并设计了研究和实验。A.K.、G.R.、I.S.、A.G.、J.O.、A.B.、M.J.T.、I.B.、E.E.J.和M.S.L.进行了实验。A.K.、G.R.、I.S.、J.O.、A.B.、C.R.、C.G.F.、J.P.、G.W.和M.S.L.分析了数据。A.K.、G.R.、I.S.、E.E.J.、C.M.、F.R.和M.S.L.解释了数据。A.K.、G.R.、E.E.J.、C.M.、F.R.和M.S.L.撰写并编辑了手稿。

利益声明

作者声明没有利益冲突。

关于手稿准备过程中使用的生成式AI和AI辅助技术的声明

不适用。

STAR

**方法**

**关键资源表**

**试剂或资源**

| 抗体 | 来源 | RRID |
|-------------------|-------------|-------------|
| Anti mCherry E5D8F | Cell Signaling Technology | Cat#43590S; RRID: AB_2799246 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat#A11001; RRID: AB_2534069 |
| Alexa Fluor 568 goat anti-chicken IgY | Invitrogen | Cat#A11041; RRID: AB_2534098 |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | Cat#A11036; RRID: AB_10563566 |
| Anti Cleaved Caspase-3 (Asp175) | Cell Signaling Technology | Cat#9661S; RRID: AB_2341188 |
| Anti Dacapo | DSHB | Cat#NP1; RRID: AB_10805540 |
| Anti GFP Polyclonal Antibody | Invitrogen | Cat#A10262; RRID: AB_2534023 |
| Anti NCAPD3 | Ethyl Labs | Cat#A300-604A; RRID: AB_2298269 |
| Anti Villin-1 (R814) | Cell Signaling | Cat#2369S; RRID: AB_2215958 |
| Anti β-Tubulin | Cell Signaling | Cat#2146S; RRID: AB_2210545 |
| Anti-BrdUBD | Biosciences | Cat#347580; RRID: AB_10015219 |
| Anti-mCherry | Sigma Aldrich | Cat#AB356481; RRID: AB_2861426 |
| Anti-Rabbit IgG (H + L) Secondary Antibody | Cytiva Lifescience | Cat#NA934; RRID: AB_772206 |
| Drosophila Dcp-1 | Cell Signaling | Cat#9578S; RRID: AB_2721060 |
| H3K9me3 | Abcam | Cat#8898; RRID: AB_306848 |
| p21 Antibody | Invitrogen | Cat#MA5-14949; RRID: AB_1098446 |

**生物样本**
人类末端回肠和结肠组织（Cleveland Clinic）

**化学品**
蛋白质测定染料试剂（Bio-Rad）：Cat#5000006

**实验模型**
腺癌衍生细胞系（来自人类）：HT29ATCCHTB-38
小肠上皮细胞系（来自大鼠）：IEC6ATCCCRL-1592

**仪器和设备**
Volocity Image Analysis Software（Quorum Technologies）：Volocity 6.3
GraphPad Prism（https://www.graphpad.com/GraphPad Prism 9.0）
公开可用的儿童CD数据集：Array Express；数据访问编号E-MTAB-8901
公开可用的成人CD数据集：Single Cell Portal；数据访问编号SCP2959

**组织来源**
癌症衍生的女性人类HT29细胞从美国典型培养收集中心（ATCC）获得，并在添加了10%胎牛血清（FBS, Life Technologies）和1%青霉素/链霉素（Gibco）的RPMI 1640培养基中培养。大鼠小肠上皮细胞系IEC6也来自ATCC，培养基中添加了10% FBS、1%青霉素/链霉素和0.1%胰岛素（Sigma Aldrich）。所有细胞系均在37°C、5% CO2的培养箱中生长，并定期检测支原体。

**实验步骤**
1. 从接受手术切除的患者组织中分离肠上皮细胞：
- 从接受手术切除的患者的中结肠或回肠组织中分离上皮细胞。
- 组织通过Cleveland Clinic组织采购服务获取，并按照Cleveland Clinic的IRB协议05–205、17–1167和19–1035获得批准，所有患者均签署了书面知情同意书。
- 将切除的肠组织中的黏膜组织切成条状，用Hank’s Balanced Salt Solution（HBSS）和150 mM DTT在室温下轻轻处理30分钟，然后加入HBSS和1 mM EDTA冲洗三次。
- 洗涤后，将组织转移到新的容器中，收集上清液。
- 最后将细胞合并，用PBS洗涤，以1500 rpm离心5分钟，分为两部分：一部分用于RNA分离，另一部分用于蛋白质提取。

**果蝇维护**
所有果蝇品系和杂交果蝇在25°C的标准玉米粉琼脂饲料（Agar 0.56%，玉米粉6.71%，灭活酵母1.59%，玉米糖浆7.0%，丙酸0.44%，Tegosept 0.15%）中维持。所有新引进的品系在加入实验室品系之前都会严格检查是否含有食物螨虫。

**质粒和细胞系转染**
使用含有N末端mCherry标签的NCAPD3完整开放阅读框的质粒（EX-T9021-M55, Genecopoeia）通过Lipofectamine 2000（Thermo Fisher）转染到细胞中，以促进NCAPD3的过表达。作为对照，转染了含有mCherry标签的背景载体（pReceiver-M55）。质粒DNA转染在6孔板中进行，使用Thermo Fisher提供的配方。细胞接种在完全培养基中。次日，用OptiMEM稀释DNA和转染试剂Lipofectamine 2000后，转染4ug的mCherry或mCherry-NCAPD3表达载体。转染过程中培养基中不含抗生素。

**免疫印迹**
细胞通过350 x g离心沉淀，然后在RIPA裂解液（300 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM Triton, 10% glycerol, 1 mM DTT, 1X protease inhibitor cocktail）中重新悬浮，并在冰上孵育15分钟。裂解液通过16 × 1000g离心清除，蛋白质通过Bradford法进行定量（Bio-Rad）。每份样本分析25 μg裂解液。电泳转移使用Immobilon-P（Millipore Sigma IPVH00010）疏水性PVDF转移膜进行。所使用的转移缓冲液为25 mM Tris Base和192 mM glycine，含有20%甲醇（体积/体积），而封闭缓冲液为5%无脂干奶粉溶于1X磷酸盐缓冲盐水（PBST）中，并加入0.1% Tween 20洗涤剂。印迹图像使用Thermo Fisher公司的SuperSignal West Pico化学发光底物进行显影，随后使用BioRad ChemiDocTM XRS+分子成像仪和Image LabTM软件以及“Protein Gel”设置对图像中的条带进行定量分析。按照制造商提供的协议，使用相同大小的窗口来计算绝对体积。在比较不同泳道的结果之前，首先将所有条带的强度值标准化到相应的加载对照水平。所使用的抗体包括：NCAPD3 1:1000（Bethyl Labs，A300-604A）、Villin-1 1:1000（Cell Signaling，2369）和β-Tubulin抗体 1:50,000（Cell Signaling，2146）。

### 培养细胞的免疫荧光分析
将HT-29和IEC6细胞接种在18毫米圆形盖玻片上，放入6孔板中进行转染。转染后不同时间点，将盖玻片在室温下的摇床中用1X PBS清洗5分钟，然后在室温下的摇床中用4% paraformaldehyde固定10分钟，最后再用1X PBS清洗5分钟。为了使细胞通透，将盖玻片浸入0.1% Triton X-100和1X PBS的混合液中，在冰上培养5分钟。之后将细胞用1X PBS清洗5分钟，在室温下的摇床中处理，再用0.5% NP-40和1% BSA封闭，并在4°C下孵育过夜。第二天，将盖玻片在室温下的摇床中用1X PBS清洗三次，每次10分钟，然后在暗处室温下孵育1小时，期间加入稀释在封闭缓冲液中的荧光标记的二抗。接着用含有DAPI的Vectashield处理盖玻片，最后将其安装到载玻片上。使用的初级抗体包括：anti-BrDU（BD Biosciences，编号347580，1:25）、anti-mCherry（Cell Signaling，编号E5D8F，1:100）、anti-Cleaved Caspase-3（Cell Signaling，编号9661）、p21抗体（Invitrogen，编号MA5-14949）、anti-NCAPD3（Bethyl Laboratories，编号A300-604A，1:100）以及anti-mCherry（EMD Millipore，编号AB356481，1:1000）。仅上传了5个年龄段（60–65岁、65–70岁等）的数据，因此每个患者的年龄被设定为其相应年龄段的中点（62.5岁、67.5岁等）。

为了将伪体积计数标准化，将每个患者的候选基因表达计数除以其肌动蛋白B（ACTB）的伪体积基因表达计数。使用stats（v4.5.0）中的cor功能，独立计算每个经过ACTB标准化的基因表达值与每个患者年龄之间的皮尔逊相关性。然后使用WGCNA（v1.73）中的corPvalueStudent计算每个相关性的学生t值的显著性。

新孵化出的果蝇按生物性别分开，并在标准培养基中饲养直至实验当天。染料培养基使用Sigma-Aldrich公司的Brilliant Blue FCF染料（CAS编号：3844–45-9）配制，浓度为2.5%（重量/体积）的5%蔗糖溶液。Kimwipes纸条浸入200 μL的染料-蔗糖溶液中，放入空试管中，每管存放24小时，每个实验使用25只果蝇。当24小时后整个身体出现染色时，记录为“Smurf”果蝇；当24小时后仅口器和肠道有染色时，记录为“Non-Smurf”果蝇。使用带有6.3:1变焦的Leica S6 E Greenough立体显微镜对果蝇进行分类和识别。“Smurf”检测方法还用于检测与衰老相关的肠道屏障功能障碍。

果蝇中肠的免疫荧光显微镜分析：
果蝇中肠的解剖和染色按照描述的协议进行，未作任何修改。使用Invitrogen公司的抗GFP抗体（1:500，目录编号A10262）来观察由esgGAL4驱动表达的细胞。使用H3K9me3抗体（1:100，Abcam #8898）来观察异染色质。使用倒置的Leica SP8共聚焦显微镜获取图像。优化激光功率和探测器设置，以获得每个通道的最大信号强度，同时尽量减少像素饱和度。从每只成年果蝇中收集中肠的z轴堆叠图像，使用相同的共聚焦显微镜设置对所有样本进行3D重建和分析。

**果蝇中肠分析的Volocity协议及H3K9me3焦点的定量：**
使用Volocity 6.3软件（Quorum Technologies，加拿大安大略省）进行图像分析和定量。在Volocity软件中创建了免疫荧光图像的库。以下步骤概述了使用Volocity软件分析果蝇肠道图像的方法，重点是确保结果的一致性和准确性。为了保持一致性，对每批图像的设置进行了标准化处理。在“图像”选项卡中选择亮度 and 黑度等级设置以最小化背景信号。将所有单个IF通道的相同值应用于每张图像，以优化可见性和一致性，同时避免过度处理。在每个样本的中肠周围绘制感兴趣区域（ROI），然后裁剪以仅生成中肠的3D重建图像。为每组图像开发测量协议。通过DAPI+细胞核的存在来定义细胞。使用分区工具将H3K9me3焦点（红色通道）分配给GFP+或GFP-细胞。对于稍微模糊的图像，对图像设置进行微调以增强清晰度。这种综合方法确保了图像分析的一致性和准确性，从而便于可靠地解释通过果蝇肠道分析实验获得的数据。

**数据表达和统计分析：**
数据以平均值±标准差（n = 3次独立实验，在相同条件下进行）表示，除非另有说明。统计分析使用GraphPad Prism（GraphPad Software）进行，对于两组数据的比较使用非配对的学生t检验或Mann-Whitney检验。对于涉及多个数据集的比较，使用带有Tukey多重比较检验的单因素方差分析（ONEWAY ANOVA）。对于Kaplan-Meier曲线，使用Gehran-Breslow-Wilcoxon检验。

**补充信息（1）PDF（1.17 MB）**
文档S1：图S1–S9和表S1