单细胞分辨率下疫苗接种者感染奥密克戎并康复后的动态免疫重塑

《iScience》：Single-cell-resolved dynamic immune remodeling following Omicron infection and recovery in vaccinated individuals

　　

要点
•奥密克戎感染驱动免疫细胞各组分协同重塑
•先天免疫迅速反弹，而适应性免疫恢复持续延迟
•持续的细胞因子和白介素变化塑造感染后免疫恢复
•疫苗接种限制早期免疫紊乱并促进更快的先天免疫恢复

摘要
尽管接种过疫苗，突破性SARS-CoV-2奥密克戎感染仍然会发生，但感染后的免疫恢复仍未被完全阐明。在此，我们对健康个体及疫苗突破感染患者的外周血单个核细胞（PBMCs）进行了纵向单细胞转录组学和靶向蛋白质组学表征，时间点涵盖感染期、早期恢复期及恢复后3个月。奥密克戎感染诱导了协调的免疫重塑：T细胞和B细胞组分收缩；浆细胞、调节性T细胞和树突状细胞扩增；以及炎症和代谢通路受到抑制，包括TNFα-NF-κB和mTORC1信号通路。先天免疫群体迅速反弹，而适应性免疫组分恢复缓慢，IL-2、IL-12和IL-15模块持续受到抑制。趋化因子激增（CXCL1、CXCL5和CXCL8）在康复期消退，而选择性细胞因子（CCL5和CCL8）和白介素（IL-6、IL-18和IL-24）则持续存在。轨迹分析揭示T细胞状态发生了不均匀的重塑，在初起、效应和记忆组分中均存在持续的分化特征。总体而言，疫苗接种缓和了早期免疫崩溃并加速了先天免疫反弹，凸显了白介素相关检查点以及代谢调控在接种后免疫韧性中的作用。

图形摘要

引言
SARS-CoV-2关切变异株（VOC）的相继出现，包括Alpha（B.1.1.7）、Beta（B.1.351）、Delta（B.1.617.2），以及最为突出的Omicron（B.1.1.529）——其特征为高突变率、传染性增强和显著的免疫逃逸——主导了COVID-19大流行，并通过快速传播和免疫逃逸使全球防控 efforts 复杂化。SARS-CoV-2的演化反映了适应性权衡，以Omicron变异株为代表，其表现出增强的传染性但毒力减弱，从而驱动差异化的致病结果和复杂的宿主免疫反应。与其他RNA病毒类似，SARS-CoV-2发生频繁突变，推动变异株快速出现和全球传播。这迫切需要广泛研究病毒演化、病理生理学和宿主反应。这些特性对自然获得和疫苗诱导的免疫均构成挑战，因此需要更深入地了解不同暴露历史人群中的宿主免疫反应。在重症病例中，对SARS-CoV-2的免疫反应至关重要地决定了疾病结局，范围从快速恢复到免疫失调、ARDS（急性呼吸窘迫综合征）和长期疾病。特别是在人口密集地区，绘制免疫反应在急性感染、恢复和康复期间如何演化的图谱至关重要，以便更好地预测疾病严重程度和长期保护力。

全球研究证据表明，SARS-CoV-2感染会引发广泛的免疫失调，涉及免疫系统的先天和适应性两个分支。单细胞转录组和免疫表型分析方法已揭示出淋巴细胞亚群、单核细胞和自然杀伤（NK）细胞的改变，同时重症病例中耗竭标志物和促炎细胞因子的表达增加。重症通常与淋巴细胞减少、细胞因子释放增高和抗原呈递受损相关，而B细胞激活受损则导致病毒清除延迟。重要的是，虽然许多研究比较了健康个体和急性感染个体，但较少研究考察了康复患者的免疫图谱，后者免疫细胞功能部分恢复，但记忆T、B和NK细胞等亚群中仍存在持续改变。更为重要的是，了解纵向恢复过程是了解接近健康谱系路径的关键。

在分子水平上，转录组和蛋白质组学研究进一步揭示SARS-CoV-2感染激活了多种免疫通路，包括干扰素信号、NF-κB介导的炎症、IL-6/JAK/STAT3信号和补体激活，这些通路共同协调抗病毒防御和免疫病理。这些发现凸显了对SARS-CoV-2的免疫反应不仅具有异质性，而且具有情境依赖性，在急性感染、重症疾病和恢复过程中各不相同。解读SARS-CoV-2感染后的免疫动态至关重要，而单细胞多组学能够高分辨率地表征异质性先天和适应性免疫细胞反应。

尽管取得这些进展，大多数现有研究专注于急性感染或健康与感染队列之间的比较，使康复个体的过渡免疫状态了解不足。这一缺口尤为重要，因为恢复并不总是意味着免疫平衡的完全恢复。在本研究中，我们旨在全面研究与SARS-CoV-2感染、恢复和长期免疫重塑相关的免疫反应，特别关注疫苗个体中的Omicron突破病例。利用单细胞多组学和免疫表征，我们考察先天和适应性免疫反应在Omicron感染期间如何被调节、如何在恢复过程中发生转变，以及康复后数月内免疫平衡和功能能力在多大程度上得以恢复。通过表征健康、感染和恢复状态下的细胞异质性、转录程序、细胞-细胞通讯动态和介质网络，本研究旨在解决有关感染后免疫持久性和质量的关键知识缺口。这些见解对于理解免疫恢复的自然过程以及为针对未来SARS-CoV-2变异株的应对策略提供信息至关重要。

结果
单细胞转录组学表征揭示接种个体在Omicron突破感染和恢复期间免疫细胞重编程

为描绘疫苗个体Omicron突破感染和恢复期间的细胞动态，我们表征了44名参与者的外周血，包括健康对照（n = 9；既往无COVID-19感染）、感染患者（n = 14；Omicron变异株）和康复个体（n = 15；从Omicron感染中康复）作为第1组，即疾病进展组，以及recovered_T1和recovered_T2个体（n = 6；康复后3个月随访）作为第2组，即康复随访组。这些患者的临床特征见表S1。外周血单个核细胞（PBMCs）被分离出来并使用BD Rhapsody Express平台进行单细胞RNA测序，随后在Illumina NovaSeq 6000平台进行测序（图1A）。经过严格的质量控制后，保留了153,075个细胞并分为13种不同的免疫细胞类型。均匀流形近似和投影（UMAP）嵌入揭示了定义明确的簇，对应于主要免疫群体，包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和树突状细胞（DCs），每种细胞均具有独特的转录特征（图1B）。细胞类型注释由表面蛋白表达（AbSeq抗体组；图1C上方面板）和胞内转录组特征（RNA表达；图1C下面板）共同指导。

图1 单细胞转录组学表征揭示健康、SARS-CoV-2感染和康复个体间的免疫细胞异质性
（A）研究设计和实验流程示意图。研究包含两个临床组：疾病进展组（包括健康个体、急性感染患者和康复个体）和康复随访组，其中一部分康复个体（n = 6，recovered_T1）在其初次康复采样（n = 6，recovered_T2）后3个月重新采样。采集外周血并分离PBMCs，随后进行文库制备和单细胞RNA测序（scRNA-seq）。
（B）153,075个单细胞的UMAP可视化，揭示13种转录上不同的免疫细胞群体。每个点代表一个单细胞，按细胞类型着色。
（C）细胞类型对表面和胞内标志物的表达情况。颜色标尺表示相对表达量，圆圈大小表示表达该标志物的细胞百分比。
（D）细胞密度UMAP图突出健康、感染和康复组之间的组成变化。
（E）柱状图显示主要免疫细胞类型在各疾病状态下的相对比例。星号表示组间具有统计学意义的差异（Fisher精确检验）。
（F）两个恢复时间点的细胞密度UMAP图：（1）recovered_T1和（2）recovered_T2。
（G）比较recovered_T1和recovered_T2组之间免疫细胞类型比例的柱状图，突出康复随访队列中的纵向变化。星号表示各亚组比较的显著性（Fisher精确检验）。

对于（E和G），应用p < 0.05的显著性阈值。根据此标准，所有比较组均具有统计学显著性，最小p值为< 0.05。

健康、感染和康复个体间免疫细胞的密度分布突出显示了SARS-CoV-2感染期间细胞组成的显著变化。在健康对照中，免疫群体广泛分布，没有任何特定亚群占主导。相比之下，感染Omicron的患者中观察到浆细胞、调节性T细胞、血小板和CD4+ T细胞的高密度簇，表明这些免疫细胞明显集中（图1D）。恢复后，细胞分布变得更加均衡，尽管这些富集亚群相对于健康对照仍保持较高密度。这表明虽然感染后免疫图谱恢复正常，但关键免疫亚群的残余扩增可能反映了持续的免疫监视和修复机制。

在Omicron突破感染的疫苗个体中，健康、感染和康复状态之间观察到免疫细胞组成的显著变化（图1E）。细胞类型比例在样本水平量化，每个供者贡献一个数据点，并以每样本组成和汇总箱线图可视化（图S1A–S1D）。在先天免疫组分（DCs、单核细胞和NK细胞）中，只有DCs在感染患者中显著增加，与健康和康复个体相比。在适应性免疫组分（T和B细胞）中，大多数T细胞亚群均观察到明显减少，包括初起CD4+ T、CD4+ T、CD8+ T、NKT和记忆T细胞，而调节性T细胞相对增加。这一模式突出了疫苗接种前仍存在的明显淋巴细胞减少以及Omicron感染期间动态的T细胞反应。B细胞在感染患者中减少，而浆细胞相对于健康和康复两组均扩增，表明体液反应受损但处于过度激活状态。

在第2组中，密度分布分析突出显示与recovered_T1相比，recovered_T2免疫细胞群体逐步消退，表明向免疫正常化转变（图1F）。使用样本水平的细胞类型比例进行纵向比较，并在个体样本和合并分布中可视化（图S2A–S2C）。然而，比较健康和recovered_T2队列时，后者细胞类型的表达更为明显。广泛免疫亚群，包括单核细胞、NK细胞和除调节性T细胞外所有T细胞群体，以及B细胞，在recovered_T2时相对于recovered_T1均显示明显增加。这些发现表明，到恢复后期，大多数免疫组分正在恢复其稳态水平（图S3A），反映出Omicron突破感染后免疫平衡的恢复（图1G）。

Omicron突破感染期间先天和适应性免疫分支的功能动态

在观察到主要免疫亚群间细胞组成变化后，我们进一步考察了潜在功能和转录程序，特别关注免疫系统的先天和适应性分支。这种二分法提供了概念框架以解读感染免疫反应：先天免疫组分通过即时、非特异性机制（如病原体识别、抗原呈递和促炎信号传导）提供第一道防线，而适应性分支则协调抗原特异性反应。这两个分支间的协调性交叉对话对有效清除病毒和持久免疫至关重要。此平衡的破坏已被认为是重症病毒感染（包括COVID-19）的标志，因此提供了审视疫苗个体Omicron突破感染的关键视角。

我们首先量化了疾病进展第1组（图2A）中先天和适应性免疫亚群的相对贡献。先天免疫组分由DCs、单核细胞和NK细胞组成，而适应性免疫组分包括所有T细胞亚群、B细胞和浆细胞。健康个体先天和适应性分支均呈现中等代表性，而感染个体先天和适应性免疫组分均出现显著减少，先天免疫组分抑制更为明显（图2B）。这在先天免疫细胞群体中主要表现为单核细胞和NK细胞减少，而适应性组分，包括T细胞亚群和B细胞，则明显收缩。相比之下，两个免疫组分中少数细胞类型，包括DCs、调节性T细胞和浆细胞，在感染个体中表达升高。康复个体向平衡免疫架构恢复，表明所观察到的偏斜主要由感染驱动（图2B；图S3A）。

这些发现表明，在活跃感染期间，先天性和适应性免疫功能均出现了暂时性崩溃。

图 2 奥密克戎突破性感染期间失调的先天 - 适应性免疫平衡、通路水平重连以及细胞因子 - 趋化因子扰动
(A) 单细胞转录组的高斯随机邻域嵌入（t-SNE）图，展示了各组先天和适应性免疫区室的分隔情况。
(B) 第一个堆叠柱状图代表健康、感染和恢复状态下先天与适应性区室的比例，突出了感染期间每个免疫分支的转变。第二个堆叠柱状图显示了不同疾病状态下先天（树突状细胞、单核细胞和 NK 细胞）和适应性（T 细胞和 B 细胞亚群）种群的相对频率。
(C 和 D) 针对（C）感染 vs. 恢复和（D）恢复 vs. 健康配对比较的先天免疫差异表达基因（DEGs）基因集富集分析（GSEA）。
(E–G) 针对（E）感染 vs. 健康、(F) 感染 vs. 恢复和（G）恢复 vs. 健康比较的适应性免疫 DEGs 的 GSEA。点图显示了归一化富集评分（NES），点的大小对应于基因比例，点内的星号表示调整后的 p 值。每个点的颜色代表特定的细胞类型。
(H 和 I) （H）先天和（I）适应性免疫细胞类型的细胞因子模块基因特征评分。
(J) 跨先天和适应性免疫细胞类型及疾病组的代表性趋化因子基因表达热图可视化。
(K 和 L) （K）先天和（L）适应性免疫细胞类型在健康、感染和恢复组中的趋化因子模块基因特征评分。
(M) 跨先天和适应性免疫细胞类型及疾病组的代表性趋化因子基因表达热图可视化。
(N 和 O) （N）先天和（O）适应性免疫细胞群体在健康、感染和恢复组中的白细胞介素模块基因特征评分。
(P) 跨先天和适应性细胞类型及疾病组的代表性白细胞介素基因表达热图可视化。点图和弦图中的星号表示每个子组比较之间的显著性（Wilcoxon 秩和检验）。显示了统计比较（*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001）。

为了阐明这些转变的分子基础，我们进行了差异基因表达（DGE）分析，随后进行了第一组配对比较的基因集富集分析（GSEA）。这使我们能够捕获通路活动的协调变化，特别关注先天和适应性免疫细胞类型，从而将细胞组成的改变与功能性免疫程序联系起来。有趣的是，结果显示 COVID-19 感染者表现出与补体激活、TNFα-NF-κB 信号传导以及单核细胞和 NK 细胞介导的炎症反应相关通路的抑制。这表明奥密克戎抑制了先天促炎信号传导，可能是作为一种限制过量细胞因子释放的免疫逃逸策略。此外，单核细胞和 NK 细胞中的糖酵解减少，表明建立强效效应反应所需的代谢活性受到抑制（图 2C）。值得注意的是，在康复个体中，许多这些通路被上调，包括单核细胞和 NK 细胞中的炎症反应、补体、TNFα-NF-κB 信号传导、IL-6-JAK-STAT 信号传导和干扰素伽马反应（图 2D），这表明病毒清除后先天免疫活动出现反弹，可能反映了免疫稳态的恢复。恢复还与细胞凋亡、上皮 - 间质转化（EMT）、缺氧、晚期雌激素反应和 KRAS 信号传导的富集有关，这可能代表组织重塑和应激适应，而单核细胞和 DC 中雄激素反应和 MYC 靶标的下调则表明康复期间激素和增殖调节发生了改变。总之，这些发现表明，奥密克戎感染在疫苗接种者的急性期抑制先天炎症通路和代谢激活，但在恢复后伴随着代偿性重新激活。

急性感染期间适应性免疫反应明显受损，感染者在 CD8+ T 细胞、调节性 T 细胞、初始 CD4+ T 细胞、记忆 T 细胞以及浆细胞中表现出 TNFα-NF-κB 信号传导、IL-2/STAT5 信号传导和细胞凋亡通路的广泛下调（图 2E），反映了淋巴细胞中广泛的免疫失调。感染组与恢复组的比较分析显示适应性程序部分重新激活，证据包括浆细胞和调节性 T 细胞中 TNFα-NF-κB 信号传导的上调，调节性 T 细胞中 IL-2/STAT5 信号传导的恢复，以及浆细胞中代谢和受体介导信号传导的增强（图 2F）。然而，适应性恢复仍不完全，因为康复个体相对于健康对照仍表现出 MTORC1 信号传导、MYC targets V1 和 TNFα-NF-κB 信号传导的抑制，特别是在调节性 T 细胞和 CD8+ T 细胞中（图 2G）。这进一步证明先天免疫转变主要由单核细胞和 DC 驱动，它们在感染期间显示抑制并在恢复期间代偿性重新激活，而适应性重建则部分迟缓，在调节性 T 细胞和浆细胞中观察到最明显的反弹。

为了进一步验证通路层面的发现，我们对免疫细胞亚群进行了血液转录模块（BTM）分析（图 S4）。结果与 Hallmark 富集一致，确认了急性感染期间活化淋巴细胞中细胞周期和转录模块（包括 MYC 和 mTORC1 信号传导）的下调。BTM 分析还突出了血小板激活和凝血相关模块（M11.1 和 M42）的抑制，特别是在与 B 细胞相关的特征中。这些观察结果支持感染期间增殖、代谢和止血程序的协调减少。

综上所述，这些发现表明，奥密克戎突破性感染在疫苗接种者中诱导适应性通路的急性抑制以及先天激活，随后在恢复期间出现强健的先天反弹和仅部分适应性恢复，与健康基线相比留下了残余的信号缺陷。

介质扰动揭示奥密克戎感染期间先天 - 适应性免疫重连

在观察到奥密克戎突破性感染导致先天和适应性免疫区室之间的平衡受到干扰及其相关通路重连之后，我们接着询问这些组成和通路层面的变化如何转化为潜在的功能性免疫效应程序。由于细胞因子、趋化因子和白细胞介素充当先天和适应性细胞之间交流的主要分子介质，我们量化了健康、感染和恢复状态下每个区室内它们的模块评分。

感染期间细胞因子模块广泛改变。跨条件和细胞类型显著改变的细胞因子、趋化因子和白细胞介素的完整列表见表 S2。先天细胞显示出细胞因子活性的明显减少（图 2H），而适应性区室则表现出相对增加（图 2I）。康复个体在两个分支中都显示出部分恢复；然而，适应性细胞因子活性仍低于健康基线。在先天区室内，NK 细胞主要是感染者细胞因子反应减弱的主要贡献者，而 T 细胞和 B 细胞的亚群在感染期间相对于健康和恢复组均表现出增高的细胞因子活性（图 S5A）。包括 CCL3、CCL4、CCL4L2 和 CCL18 在内的促炎介质在 NK 细胞中的表达降低。相比之下，诸如 CCL5、CCL8、CCL11、CCL24 和 CCL28 等细胞因子在感染者中富集，主要存在于 CD4+ T 细胞、调节性 T 细胞、NKT 细胞和浆细胞中，突出了感染和恢复期间细胞因子调节的区室特异性分歧（图 2J）。

另一方面，趋化因子表达在感染期间在先天和适应性区室中均十分显著，但在恢复状态下明显下降，这表明由趋化因子驱动的炎症是暂时的，并在感染后消退（图 2K 和 2L）。先天和适应性细胞均对感染者的趋化因子激增做出了贡献（图 S5B）。在感染者中，DC 和单核细胞显示出较高的趋化因子表达，包括 CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL8 和 CXCL14。另一方面，包括 CXCL1、CXCL5、CXCL6、CXCL9、CXCL14 和 CXCL16 在内的趋因子的表达主要在 CD8+ T 细胞、调节性 T 细胞和浆细胞中增加（图 2M）。尽管通路水平富集分析表明感染者的免疫和炎症程序总体受到抑制，但模块评分揭示了离散细胞亚群中选择性的趋化因子激活，突出了广泛收缩反应中的细粒度免疫激活。

白细胞介素模块活性显示出了类似的抑制模式。先天细胞在感染期间表现出白细胞介素信号传导减少，恢复时略有反弹（图 2N），而适应性细胞则显示出白细胞介素活性的持续减弱（图 2O；图 S5C）。与健康对照相比，感染者中大多数白细胞介素的表达在先天和适应性区室中均降低，涵盖促炎（IL-1A、IL-1B、IL-6、IL-17 和 IL-18 家族）、调节性（IL-10 和 IL-27）以及稳态/γ-链细胞因子（IL-2、IL-7 和 IL-15）。在先天细胞中，白细胞介素表达在恢复时部分反弹，表明炎症和组织修复通路的恢复（例如 IL-1、IL-6 家族和 IL-24）。在适应性免疫细胞中，白细胞介素表达模式在各组之间仅显示温和的差异，康复个体的水平总体上与健康对照相当，相对于感染者而言部分向基线转变。IL-12、IL-15、IL-23 和 IL-26 遵循类似的趋势，没有明显的组特异性分歧。总体而言，这些观察结果表明感染解决后白细胞介素信号传导的动态但逐渐正常化，而不是适应性细胞因子网络的完全或突然恢复（图 2P）。

综上所述，这些发现揭示了介导恢复过程中的区室特异性分歧。虽然先天细胞在感染后恢复了细胞因子、趋化因子和白细胞介素活性，但适应性分支在这些模块上仍保持转录抑制状态。这种不对称恢复突出了持续的适应性信号缺陷，可能会损害奥密克戎突破性感染后的长期免疫适应性和疫苗回忆反应。

SARS-CoV-2 感染和恢复期间先天 - 适应性细胞通讯的重组织

为了确保我们的发现反映真实的生物学串扰，我们使用 ICELLNET 进行了细胞通讯分析，该分析明确考虑了多亚基蛋白复合物，并根据簇特异性表达阈值缩放通讯评分。我们检查了从先天发送者（DC、单核细胞和 NK 细胞）到适应性接收者（T 细胞亚群、B 细胞和浆细胞）的配体 - 受体（L-R）相互作用，涵盖健康、感染和康复个体（表 S3）。我们没有评估接触强度的净变化，因为这可能会受到不同状态下不同 L-R 对的混淆，而是将相互作用分类为不同的功能模块（激活/共刺激、抑制/检查点、趋化吸引/归巢以及营养/生存），以评估疾病阶段之间的定性信号转变。

与健康个体相比，感染患者表现出通讯强度的明显功能重塑，而康复个体在很大程度上恢复了稳态特征（图 S5D–S5F）。DC 在感染期间显示出分叉的功能特征（图 3A）。支持 CD8+ T 细胞、B 细胞和浆细胞的相互作用收缩，伴随着免疫反应通路中 CD6/ALCAM 信号传导的减少以及 DC 发育和细胞因子释放通路中 FLT3LG/FLT3 营养活性的减弱。相比之下，DC 串扰在质上重新导向记忆、初始 CD4+ T 细胞、CD4+ T 细胞和 NKT 细胞，通过促炎趋化吸引（CXCL14/CXCR4）、信号转导（CADM1/CRTAM 和 NRXN1/ADGRL1）以及细胞增殖轴（CD47-SIRP）。在恢复期间，对 CD8+ T 细胞和初始 CD4+ T 细胞的输入接近基线，而与 CD4+ T 细胞和 NKT 细胞的联系保持高水平。同时，B 细胞支持（包括 B 细胞激活/生存通路中的 TNFSF13B/TNFRSF13C）下降，表明向细胞效应分支而非体液支持的持续偏移。单核细胞同样表现出功能转换，而不仅仅是接触频率的简单转变。在感染期间，单核细胞与初始 CD4+ T 细胞和记忆 T 细胞的通讯主要由激活共刺激（CD86/CD28）和炎症趋化吸引（CXCL10/CXCR3）主导（图 3B）。在康复期，虽然对记忆池的支持仍然升高，但信号的性质通过 CD86/CD28、LAG3、HLA-DR 和 LGALS3 转向免疫调节信号，以调节早期 T 细胞活化。到恢复阶段，对 CD4+ T 细胞和 NKT 细胞的递送超过了健康和感染水平，而与 CD8+ T 细胞、调节性 T 细胞和浆细胞的通讯收缩。NK 细胞显示出以细胞毒性调节和免疫消退为中心的独特轨迹（图 3C）。与 CD8+ T 细胞的接触从健康到恢复阶段逐渐下降，而向 CD4+ T 细胞和 B 细胞的信号传导在康复期间增加。记忆 T 细胞和 NKT 细胞链接保持高于基线，浆细胞通讯通过 FASLG/FAS、NECTIN1/CD96、CD160/TNFRSF14、CD86/CTLA4、HLA-DQA2/LAG3 和 HLA-C 反弹，涵盖增殖、信号转导和耐受通路（图 S6；表 S4）。具体而言，FASLG/FAS 可能通过活化诱导的细胞死亡调节浆细胞稳态，而 NECTIN1/CD96 和 CD160/TNFRSF14 支持细胞毒性淋巴细胞活化和免疫监视。共刺激和抑制轴（包括 CD86/CTLA4 和 HLA-DQA2/LAG3）突出了激活和耐受之间的平衡，防止过度免疫激活。HLA-C 相互作用进一步表明向 CD8+ T 细胞持续呈递抗原，支持适应性免疫参与。此外，恢复后期 NK 细胞与浆细胞之间相互作用的增加反映了它们在调节体液微环境稳定性方面的支持作用。

综合上述观察结果，感染后免疫记忆和信号传导得到优先保留，这使得增殖与耐受之间维持平衡，而非激活整个免疫系统。

**图3 奥密克戎突破性感染中固有-适应性免疫通讯及T细胞分化动力学的改变**

(A–C) 圆形树状图展示了不同条件下固有免疫（发送细胞）与适应性免疫（接收细胞）亚群之间预测的配体-受体相互作用。图中(A)树突状细胞、(B)单核细胞和(C)NK细胞与T细胞亚群、B细胞和浆细胞在健康、感染和康复个体中的通讯关系。圆圈大小表示相互作用强度，彩色圆点代表特定的发送-接收关系。

(D) 以亚群身份着色的T细胞UMAP嵌入图。

(E) 跨不同条件中T细胞亚群不同轨迹的拟时间轨迹。

(F) 箱线图展示健康、感染和康复组以及五种T细胞亚群（初始CD4+ T、CD4+ T、CD8+ T、调节性T和记忆T）在健康、感染和康复个体间的拟时间分布。图中显示统计比较结果（\*p < 0.05, \*\*\*\*p < 0.0001）。

综合这些发现，SARS-CoV-2感染重新分配了固有"辅助"信号，增强了指向初始T细胞、CD4+ T细胞和记忆T细胞的激活和趋化信号，同时暂时维持对B细胞、浆细胞和调节性T细胞回路的支持。康复期出现部分正常化，但保留了对效应-记忆细胞间通讯的偏好，这与基因表达趋势相呼应，表明在奥密克戎突破性感染后，调节性和体液通讯的完全恢复滞后于效应臂的恢复（图S7）。

**T细胞亚群的时间重编程定义了COVID-19期间的免疫轨迹**

为了描绘适应性免疫从健康状态经感染到恢复的演变过程，我们构建了第1组（健康、感染和康复）中T细胞亚群的拟时间轨迹（图3D和3E）。这有助于解析转录重编程的方向性，并揭示了显著的阶段性特征。

在研究不同疾病状态下各细胞类型的拟时间变化时，感染后初始CD4+ T细胞的拟时间显著增加（与健康组相比p < 0.0001），这一趋势在恢复期持续（与健康组相比p < 0.0001，而与感染组相比无显著差异），这是由于系统性激活、干扰素刺激基因表达和早期启动所致。相比之下，记忆T细胞在感染急性期表现出明显的拟时间升高（p < 0.0001），且在康复个体中仍然维持（与健康组相比p < 0.0001）。这表明记忆群体的持续印记和稳定化。CD4+ T细胞在急性感染期的细胞分化程度最大，与健康个体相比差异显著（p < 0.0001）。感染清除后，CD4+ T细胞几乎恢复至基线水平，与康复个体之间无显著差异（与康复组相比无显著性）。感染期CD8+ T细胞在拟时间上出现突然激增（与健康组相比p < 0.0001），与其细胞毒程序激活同步。此后，感染清除后CD8+ T细胞数量出现下降（p < 0.0001 vs. 感染组）。在急性感染时调节性T细胞（Tregs）的拟时间出现短暂峰值，以对抗过度炎症，康复后则明显减少（p < 0.0001 vs. 感染组）。

从拟堆积分析来看，健康、感染和康复条件下T细胞的拟时间存在显著差异。具体而言，感染样本的T细胞拟时间显著高于健康样本（p < 0.0001），表明感染急性期T细胞分化增强。此外，康复样本的拟时间显著低于感染样本（p < 0.0001）。康复状态下较低的拟时间值意味着感染恢复后分化状态得到了部分恢复。然而，康复样本的T细胞拟时间值仍与健康样本存在显著差异。

综合这些多层次分析，奥密克戎突破性感染触发了固有和适应性免疫的短暂崩溃，随后出现强劲的固有免疫反弹，而适应性免疫仅部分恢复，在CD8+ T细胞、记忆T细胞和调节性T细胞中残留信号和轨迹印记。

**恢复进程中免疫扰动的功能恢复**

鉴于第1组中康复个体相对于健康基线仍表现出部分免疫通路抑制，我们进一步检查恢复时间是否影响免疫重建。为此，我们将康复个体分为早期（recovered_T1）和晚期（recovered_T2）阶段，并比较这些亚组间的细胞组成和通路活性。我们首先量化了recovered_T1和recovered_T2中固有免疫和适应性免疫亚群的相对贡献（图4A）。早期康复（T1）个体保留了免疫失衡的迹象，淋巴细胞频率降低且固有免疫亚群过度代表，而晚期康复（T2）则显示向类似健康的分布恢复（图S3A）。T2期固有免疫和适应性免疫比例均正常化，淋巴细胞减少症基本解决，单核细胞、树突状细胞和NK细胞等固有免疫亚群恢复平衡（图4B）。这些发现表明，奥密克戎突破性感染后恢复接近基线免疫结构至少需要感染后3个月。

**图4 早期和晚期恢复阶段间免疫平衡及细胞因子-趋化因子的正常化**

(A) recovered_T1和recovered_T2间单细胞转录组的t-SNE嵌入图，堆积柱状图表示固有免疫与适应性免疫区室的占比。

(B) 堆积柱状图展示早期（recovered T1）和晚期（recovered T2）恢复期树突状细胞、单核细胞、NK细胞及适应性亚群（T细胞和B细胞）的相对频率。

(C和D) recovered_T1和recovered_T2间(C)固有免疫差异表达基因和(D)适应性免疫差异表达基因的GSEA分析。点图显示NES值，点大小对应基因比率，点内星号表示校正p值。每个点的颜色代表特定细胞类型。

(E和F) recovered_T1和recovered_T2间(E)固有免疫和(F)适应性免疫区室的细胞因子模块基因特征评分。

(G) 代表性细胞因子基因表达热图。

(H和I) recovered_T1和recovered_T2间(H)固有免疫和(I)适应性免疫区室的趋化因子模块基因特征评分。

(J) 代表性趋化因子表达谱热图。

(K和L) recovered_T1和recovered_T2间(K)固有免疫和(L)适应性免疫区室的白介素模块基因特征评分。

(M) 代表性白介素表达热图。

星号表示各亚组比较的显著性（Wilcoxon秩和检验）。统计比较结果如图（\*p < 0.05, \*\*p < 0.01, \*\*\*p < 0.001, \*\*\*\*p < 0.0001）。

为进一步评估细胞重建背后的功能变化，我们对recovered_T1和recovered_T2进行了通路富集分析。在固有免疫细胞中，特别是NK细胞，TNFα-NF-κB信号通路、凋亡、脂肪酸代谢和MTORC1等通路在T2期仍处于下调状态，反映了过度激活的细粒度收缩。然而，与健康对照组直接比较时，这些通路在recovered_T2中仍然富集，固有和适应性免疫区室中的其他主要免疫程序亦然，表明T2期代表选择性正常化阶段而非完全抑制，存在高于基线的持续免疫激活（图4C；图S3B和S3C）。相比之下，适应性免疫细胞在晚期恢复期表现出免疫相关通路的相对上调，包括TNFα-NF-κB信号通路、干扰素-γ反应、移植物排斥和顶端连接信号，反映了效应和调节功能的逐步恢复（图4D）。尽管如此，某些亚群保留了不完全恢复的迹象：B细胞和记忆T细胞显示凋亡和代谢通路的持续下调，而应激和增殖相关通路如上皮-间质转化（在B细胞中）、G2M检查点和未折叠蛋白反应（在记忆T细胞中）以及胆固醇稳态（在初始CD4+ T细胞中）受到抑制。跨细胞类型的互补BTM分析揭示了康复过程中一致的模块水平变化，与通路富集结果一致（图S8）。综合这些发现，免疫恢复具有时间精细化的特征：固有免疫反应在早期恢复期强烈反弹，至recovered_T2期收缩，而适应性免疫臂逐步恢复功能活性。这一转变强调了适应性免疫延迟但持续的重建过程，表明需要延长的康复期才能实现免疫功能的完全恢复。

**介质恢复凸显晚期康复中免疫反应的反弹**

在表征感染驱动的介质程序变化（图2）之后，我们接下来询问这些信号是否在延长恢复后正常化。因此，我们比较了早期（recovered_T1）和晚期（recovered_T2）康复期的基因模块评分。基因特征评分显示，与recovered_T1相比，recovered_T2期固有免疫细胞（单核细胞和NK细胞）中的细胞因子活性总体增加，而适应性免疫区室在大多数T细胞亚群中细胞因子模块评分普遍降低（图4E和4F；图S9A；表S5）。值得注意的是，一部分激活的适应性细胞，包括CD4+ T细胞和NK T细胞，在recovered_T2期选择了如CCL4、CCL5、CCL18和CCL28等介质出现适度增加（图4G），提示效应信号呈细胞状态限制性重新出现，而非广泛的适应性免疫激活。相比之下，趋化因子模块在recovered_T2期下降（图4H和4I；图S9B）。我们发现树突状细胞/单核细胞中CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5和CXCL8等招募信号表达降低，适应性细胞亚群中CXCL9、CXCL14和CXCL16表达降低（图4J；图S9B）。这一模式与感染驱动的迁移信号在晚期恢复期间消退一致。

白介素网络显示出最清晰的区室特异性差异。固有免疫细胞在recovered_T2期白介素活性显著增加（图4K；图S9C），伴随IL-1B、IL-6、IL-18和IL-24表达增加（图4M），表明在受控水平下炎症和组织修复程序被重新激活。相比之下，适应性免疫细胞在Recovered_T2期白介素模块评分总体略有增加（图4L），反映了亚群间的异质性反应。具体而言，CD8+ T细胞、调节性T细胞和浆细胞表现出白介素活性增加，而大多数其他适应性亚群IL-2、IL-12、IL-15、IL-23和IL-26水平降低（图4M）。综合这些发现，表明恢复轨迹是分阶段和非对称的，其中固有免疫白介素信号被广泛重新激活，而适应性白介素程序在晚期康复期间保持亚群限制性且未完全正常化。

尽管通路富集分析显示T2期固有免疫细胞中广泛炎症和代谢程序的持续下调，但模块评分揭示了在离散亚群中有限一组白介素的表达增加。这表明随着恢复进展系统性效应通路收缩，而靶向的细胞因子/组织修复程序被选择性重新激活，指示了细粒度重编程而非固有免疫的全球性重新激活。

**恢复进程中固有-适应性通讯的重塑**

为进一步阐明免疫重塑在恢复轨迹中的功能后果，我们检查了早期（recovered_T1）和晚期（recovered_T2）康复期固有免疫发送者与适应性接收者之间的配体-受体相互作用（表S6；图S9D和S9E）。我们并非量化净相互作用能力，而是追踪这两个恢复时间点之间的定性通路变化。

树突状细胞与CD8+ T细胞保持相对稳定的联系，但与其他伙伴之间表现出分歧性调控（图5A）。在T1和T2之间，靶向记忆和CD4+ T细胞的趋化和信号转导通路（CXCL14/CXCR4和CADM1/CRTAM）消退。同时，树突状细胞对初始CD4+ T细胞、NK T细胞、B细胞和浆细胞的输入增强。CD47/SIRPα和FGF/FGFR对增殖/耐受轴的调控下调，表明活跃的记忆监测正在减弱并向免疫稳态转变。相反，T1期的CCL16/CCR5信号提示了支持NK T和B细胞记忆及组织修复的短暂激活，至T2期随着长期免疫稳定性的建立而消退。单核细胞表现出选择性功能重定向。与CD8+ T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞、初始CD4+ T细胞和B细胞的相互作用收缩，而与CD4+ T细胞、浆细胞和NK T细胞的通讯得以维持或增强（图5B）。这些联系通过共刺激/共抑制对（CD80/CD28和CD80/CTLA4）、存活/凋亡对（TNFSF/TNFRSF）以及调控信号（HLA-DRA/LAG）介导，凸显了在效应和抗体定向信号保留的同时，早期记忆监测模块被下调。

NK细胞将其信号输出从CD8+ T细胞、记忆T细胞和广泛CD4+ T细胞重新导向调节性T细胞和浆细胞，与这些靶细胞的连接性显著增加，主要通过CD160/TNFRSF14免疫调节轴介导（图5C；表S7；图S10）。这些发现共同揭示，随着康复进程推进，固有-适应性信号传导从T1阶段的效应/记忆偏向逐步转向T2阶段的调节性和抗体辅助程序。树突状细胞（DCs）成为驱动初始CD4+ T细胞池更新的关键因素，单核细胞精细调节浆细胞与NK T细胞之间的相互作用，而NK细胞则增强免疫耐受和体液维持，反映出病毒清除后免疫网络的稳定化状态。

图5 早期恢复期与晚期恢复期之间固有-适应性通信及轨迹动态的重构

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（A–C）圆形树状图展示了恢复阶段中固有免疫细胞与适应性亚群之间的配体-受体相互作用：（A）树突状细胞，（B）单核细胞，（C）NK细胞与recovered_T1和recovered_T2中的T细胞和B细胞群体。（D）UMAP嵌入图，以细胞类型标识着色T细胞亚群，涵盖不同恢复阶段。（E）T细胞亚群的拟时轨迹重建，展示了recovered_T1与recovered_T2之间连续的细胞分化和状态转变。（F）箱线图展示了recovered_T1与recovered_T2以及五种T细胞亚群（初始CD4+ T、CD4+ T、CD8+ T、调节性T和记忆T细胞）的拟时分布，突出了早期与晚期恢复阶段之间的显著变化。星号表示组间统计显著性（Wilcoxon秩和检验）。统计比较结果已标注（**** p < 0.0001）。

综合以上纵向研究发现，随着恢复进程推进，固有-适应性通信从以效应/记忆为中心的激活状态逐步演进为调节性和体液维持模式。树突状细胞成为驱动初始CD4+ T细胞池更新和B细胞存活的关键因素，单核细胞在调控浆细胞和NK T细胞接触的同时收缩免疫耐受通路，而NK细胞则加强共抑制和抗体辅助回路。这种逐步再平衡强调了病毒清除后免疫网络的稳定化，表明免疫耐受和记忆稳态的完全恢复仅在效应和体液臂得到保障之后才会发生（图S11）。

T细胞拟时轨迹的渐进性下降标志着Omicron感染后的康复进程

为探讨T细胞状态在康复期间的演变，我们重建了第2组（recovered_T1和recovered_T2）中T细胞亚群的拟时轨迹（图5D和5E）。第2组的T细胞轨迹分析显示，在早期恢复阶段（recovered_T1）与随访阶段（recovered_T2）之间3个月的纵向时间间隔内，谱系特异性T细胞内的分化动态发生了条理有序的重组。

对第2组T细胞亚群发育的分析显示，recovered_T1和recovered_T2样本组之间的发育成熟度发生了显著变化。与recovered_T1样本相比，recovered_T2组中的初始CD4+ T细胞、CD4+ T细胞和记忆T细胞的拟时值显著增加，表明它们在后者中处于相对成熟或已分化的状态。相比之下，CD8+ T细胞和调节性T细胞这两种T细胞群体在后一恢复组中的拟时值显著降低。这意味着，尽管T细胞亚群的成熟度随时间推移而增加，但某些亚群（如CD8+ T细胞和调节性T细胞）的成熟和发育速率可能已经达到峰值。

就第2组的轨迹分析而言，在T1和T2时间点之间的3个月期间，T细胞群体似乎发生了复杂的重组。鉴于T1和T2之间拟时值的显著下降，整个系统似乎经历了一个从高速度急性恢复模式到免疫状态稳定化的转变。这种转变主要是由CD8+ T细胞和调节性T细胞拟时值的显著下降所驱动的。相反，纵向数据显示，在T2阶段，包括初始CD4+ T细胞、CD4+ T细胞和记忆T细胞在内的T细胞亚群的拟时值有所增加。因此可以推断，在效应细胞类型收缩的同时，记忆T细胞群体在这一过程中正在得到精炼。初始CD4+ T细胞拟时值的增加可能代表该细胞群体在Omicron感染相关急性炎症状态消退3个月后出现的"老化"趋势。

综合以上观察，这些结果表明Omicron突破性感染后的康复代表了一个分阶段的免疫恢复过程，而非简单地回归基线。虽然固有回路在早期进行再校准，但适应性信号在T1和T2之间仍保持低迷状态，反映出一种渐进恢复但尚未完成的轨迹。

讨论

了解免疫反应在已接种疫苗个体遭受Omicron突破性感染后如何受到扰动并随之恢复，对于指导疫苗接种策略和解读保护相关性指标至关重要。尽管已有大量研究表征了急性COVID-19期间和初次感染后的免疫改变，但对于既往已接种疫苗的群体感染高免疫逃逸变异株后的免疫恢复轨迹，目前了解仍然有限。本研究独特地将纵向单细胞转录组和蛋白质组学分析结合T细胞轨迹和细胞间通信分析，以深入解析已接种疫苗个体Omicron突破性感染后的免疫恢复，揭示了固有免疫与适应性免疫之间的时间不对称性、持续性的转录印记以及免疫区室间的机制协调。

我们的数据揭示了一个分阶段的免疫反应。急性感染以T细胞和B细胞群体及代谢程序的广泛收缩为特征，同时浆细胞和树突状细胞出现选择性扩增，反映了全身性炎症/凝血功能障碍以及持续但受损的体液免疫应答。类似的淋巴细胞减少和功能抑制已在早期COVID-19研究报告中观察到，通常与细胞凋亡、向炎症组织迁移或干扰素驱动的耗竭有关。值得注意的是，我们观察到调节性T细胞群体相对保留以及固有免疫的快速反弹，提示Omicron感染期间免疫扰动更具调控性。鉴于这些早期变化，我们接下来考察了恢复是否在固有免疫和适应性免疫方面遵循相似或不同的动力学。

固有免疫群体，特别是树突状细胞、单核细胞和NK细胞，显示出炎症和代谢特征（包括TNFα-NF-κB和糖酵解）的初始减弱，随后在恢复期出现强烈反弹。SARS-CoV-2和其他RNA病毒对宿主代谢和mTORC1信号通路的干扰已被证实，这为观察到的固有免疫短暂抑制提供了合理的机制解释。相比之下，适应性区室的恢复更为缓慢：已知参与T细胞增殖和记忆维持的白细胞介素模块（如IL-2、IL-12和IL-15）在感染后长达3个月内仍处于抑制状态。直接追踪已接种疫苗个体Omicron突破性感染后这些白细胞介素模块的纵向研究很少见；然而，现有证据表明T细胞功能在早期康复期可能持续改变。严重COVID-19中已报道感染后3个月存在持续性T细胞激活和修改后的IL-15应答性，并且在以Omicron刺突肽刺激时，疫苗诱导的CD4+ T细胞中IL-2产生的频率降低也已被描述。结合其他显示感染后前3–4个月T细胞转录谱持续演变的纵向分析，这些发现支持一种模型，即固有免疫反应快速重新平衡，而适应性程序恢复更慢，白细胞介素相关通路可能制约免疫稳态的完全恢复。

介质动态反映了这种不对称性。感染伴随趋化因子（CXCL1、CXCL2、CXCL5和CXCL8）的激增及招募信号的增强，这些在恢复期逐渐消退，与其他队列中描述的急性炎症消退过程相一致。CCL5和CCL8等细胞因子在炎症峰值后持续存在，可能维持免疫监视。白细胞介素分歧最为明显：固有免疫亚群选择性重新激活IL-1β、IL-6、IL-18和IL-24，这与受控的组织修复反应一致，而T细胞和B细胞维持了低水平的IL-2/IL-12/IL-15活性，表明生长和分化信号的恢复延迟。

我们的分析并非依赖广泛的非特异性相互作用评分，而是聚焦于主要且经实验验证的免疫调控检查点。细胞间通信分析进一步突出了这些介质变化如何协调免疫恢复。急性感染期间，树突状细胞通过趋化、突触形成和存活通路（包括CXCL14/CXCR4、CADM1/CRTAM、NRXN1/ADGRL1和CD47/SIRPα）向T细胞和B细胞区室发出信号，而单核细胞通过CXCL10/CXCR3、CD86?CD28/CTLA4和TNFSF/TNFRSF回路强化效应偏向。TNFSF13B/TNFRSF13C介导的B细胞支持在整个感染期间持续存在，维持了体液免疫潜能。

NK细胞通过FASLG/FAS、NECTIN1/CD96和CD16/TNFRSF14支持记忆臂，而CD86/CTLA4、HLA-DQA2/LAG3和HLA-C等抑制性轴则限制了过度激活。恢复过程涉及这些通信的逐步重新路由。早期康复期（T1）通过CXCL14/CXCR4和CADM1/CRTAM维持树突状细胞对记忆和CD4+ T细胞的支持，而晚期恢复期（T2）则通过CCL16/CCR5和TNFSF13B/TNFRSF13C加强与初始CD4+ T细胞、NK细胞、B细胞和浆细胞的相互作用。单核细胞调整了输出信号，收缩了与初始CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、调节性T细胞和记忆T细胞的相互作用，同时通过CD80/CD28、CD80/CTLA4、TNFSF/TNFRSF和HLA-DRA/LAG3维持向初始CD4+ T细胞、浆细胞和NK T细胞的信号传导。NK细胞通过CD16/TNFRSF14和免疫耐受通路将输出从CD8+ T细胞/记忆T细胞亚群重新导向调节性T细胞和浆细胞，随着HLA-C调节限制了过度激活，体液和抑制性网络得到巩固。这些观察突出了协调的细胞间通信如何桥接早期固有免疫反弹和适应性免疫的延迟再校准。

根据上述适应性免疫延迟再校准的情况，我们的谱系分段T细胞发育分析揭示，恢复过程远非对感染前状态的即时逆转，而是涉及T细胞区室的特异性谱系重组。T细胞不同谱系在感染后展现出不同的发育轨迹：CD8+ T细胞和调节性T细胞（Tregs）具有独特的急性后阶段，在此阶段发生收缩和功能重置（p < 0.0001），从而防止免疫病理慢性化并恢复免疫耐受。相反，记忆T细胞和初始CD4+ T细胞在整个恢复期均维持在较高的拟时状态（与健康对照相比p < 0.0001），这源于其持续的预激活状态和干扰素刺激印记。值得注意的是，包括效应群体收缩与初始和记忆区室持续成熟在内的对向性纵向趋势，表明免疫恢复涉及选择性精炼而非均匀性消退。

这种解耦的轨迹与白细胞介素信号减少的持续性一致，并支持一种适应性免疫并非完全重置而是建立重新定义的稳态的模型。在其他RNA病毒感染后和post-COVID研究中已报道类似的持久性免疫特征，显示持续存在的效应-记忆偏向。综合而言，这些观察提示存在一种残余的免疫"疤痕"，反映了T细胞状态相对于基线的持续偏离，并表明感染后免疫景观发生了持久的重塑。

综合以上所有观察，我们支持一个统一模型，即Omicron突破性感染驱动免疫区室的短暂但协调的重编程。急性感染以适应性免疫状态的收缩和白细胞介素相关信号的选择性抑制为特征，随后是快速但不均匀的恢复，其中固有免疫程序比适应性回路更早重新平衡。T细胞轨迹动力学进一步表明，恢复并非完全回归基线，而是T细胞状态的选择性重塑，具体表现为特定亚群中持续的分化特征以及初始、记忆和效应群体之间的异步成熟。长期存在的免疫特征类似残余"疤痕"的存在进一步证实了这一点，反映了与感染前免疫架构的持续偏离。

尽管我们的分析可能受限于样本量以及关注循环细胞而非组织驻留免疫，但整合的多组学和基于轨迹的框架为Omicron感染后免疫重组提供了全面视角。理解这一连续谱对于定义突破性感染后的免疫稳态以及识别调节适应性再校准的通路——特别是那些与白细胞介素信号和T细胞状态稳定性相关的通路——具有重要意义。未来整合黏膜免疫、抗体广谱性和长期临床预后的研究将进一步阐明这些协调的免疫动力学如何促进对不断演变的SARS-CoV-2变异株的持久保护。

研究局限性

尽管我们的研究为Omicron感染后的免疫恢复提供了重要见解，但某些局限性需要承认。研究结果仅限于外周血单个核细胞（PBMCs），而对组织驻留免疫的评估可能提供更完整的全身性和局部性免疫重塑理解。参与者未按疫苗类型或既往感染史进行分层，这可能影响个体免疫轨迹的差异。未进行白细胞介素信号和细胞间通信的功能验证，机制确认有待未来研究。此外，随访期仅限于3个月，适应性重塑的长期持久性仍待进一步探索。

此外，虽然人口学差异（如年龄和性别）可能影响免疫反应，但这些影响不能完全排除，并可能导致免疫轨迹的变异性。最后，未来研究的队列规模可以更大；然而，纵向单细胞分析方案捕获了高分辨率的时间动态，并揭示了协调的固有免疫-适应性免疫恢复模式。尽管存在这些局限性，我们的发现为理解疫苗接种后的免疫韧性提供了稳健且有价值的框架，并为未来关于SARS-CoV-2恢复的研究提供指导。

资源可用性

主要联系人

如有进一步信息和资源的请求，请联系主要联系人Rajesh Pandey（[e-mail]），由其提供答复。

材料可用性

本研究未生成新的独特试剂和材料。

数据与代码可用性

- 本研究生成的原始和分析后的单细胞RNA-seq数据集已存储于GEO（GSE303208）和SRA（BioProject PRJNA1293800），自发表日期起公开可获取。登录号详情见关键资源表。

- 所有用于样本去混洗、微生物谱整合、统计分析和数据可视化的自定义脚本可在GitHub上获取：https://github.com/INGEN-HOPE/Intracellular-Microbial-Analaysis-of-BD-Rhapsody-Wta-Abseq-data

- 重新分析本研究数据所需的任何附加信息或资源，均可向主要联系人索取。

致谢

我们衷心感谢所有研究参与者提供的宝贵贡献。作者感谢Aradhita Baral博士在与资助机构联络方面提供的指导和协调支持。我们感谢实验室经理Bharti Kumari博士和Puja Roy确保实验所需所有试剂的顺利提供和管理。我们还感谢Anil Kumar和Nisha Rawat在样本采集、运输和整理方面提供的帮助。K.K.感谢印度科学与工业研究委员会（CSIR）提供的研究奖学金对本工作的支持。本研究由Bill and Melinda Gates基金会资助，项目编号INV-033578，授予R.P.。

作者贡献

K.K.：构思、方法学、形式分析、调查、数据管理、可视化以及撰写——原稿；S.K.：方法学、形式分析、调查、数据管理、可视化以及撰写——原稿；P.C.：构思、方法学、单细胞实验、形式分析、可视化以及撰写——原稿；S.H.：数据管理和撰写——原稿；M.B.：数据管理和撰写——原稿；A.G.：数据管理和撰写——原稿；A.P.：数据管理和撰写——原稿；J.S.：单细胞实验；B.T.：资源；S.B.：资源；R.P.：构思、监督、获取资金、调查、可视化、项目管理以及撰写——审阅和编辑。所有署名作者均已阅读手稿并同意发表。

利益声明

作者声明不存在竞争性财务或非财务利益。我们亦确认资助机构在研究的规划、执行以及从研究中得出的推论方面未发挥任何作用。

STAR★方法

关键资源表

| 试剂或资源 | 来源 | 编号 |
|---|---|---|
| TRUPCR? SARS-CoV-2 RT qPCR试剂盒 | 3B Black | BioCat# 3B306 |
| BD人单细胞多重检测试剂盒 | Becton Dickinson | Cat# 633781 |
| BD Rhapsody WTA扩增试剂盒 | Becton Dickinson | Cat# 633801 |
| BD Rhapsody cDNA试剂盒 | Becton Dickinson | Cat# 633773 |
| AMPure XP | Becton Dickinson | Cat# A63881 |
| Qubit dsDNA HS检测试剂盒 | Invitrogen | Cat# Q32854 |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | Cat# 5067–4626 |
| NovaSeq 6000 S4试剂试剂盒（300循环） | Illumina | Cat# 20028312 |

已存储数据

| 原始和分析后的单细胞数据 | 本文 | SRA BioProject: PRJNA1293800；GEO: GSE303208 |

软件和算法

| 工具 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| bcl2fastq 2.19 | NA | GitHub - brwnj/bcl2fastq: NextSeq专用bcl2fastq2包装器 |
| STARsolo 2.7.9a | Kaminow等 | https://github.com/alexdobin/STAR/releases |
| CellMarkerDB | Hu等 | http://biocc.hrbmu.edu.cn/CellMarker |
| PanglaoDB | Franzén等 | https://panglaodb.se/index.html |
| ICELLNET v2 | Massenet等 | https://github.com/soumelis-lab/ICELLNET |
| InterCellar | Interlandi等 | https://github.com/martaint/InterCellar |
| Monocle 3 | Trapnell等 | https://github.com/cole-trapnell-lab/monocle3 |
| Prism 9 | GraphPad | https://www.graphpad.com/ |
| Rawgraphs 2.0 beta | NA | https://app.rawgraphs.io/ |
| Seurat 5.3.0 | Hao等 | https://github.com/satijalab/seurat |
| R 4.5.0 | NA | https://cran.r-project.org/ |

实验模型和研究参与者详情

人样本与伦理许可

本研究的所有程序均按照《赫尔辛基宣言》原则、相关当地法规和机构指南进行。本研究已获得印度科学与工业研究委员会-基因组学与整合生物学研究所（CSIR-IGIB）机构伦理委员会（IEC）的批准（参考文献号：CSIR-IGIB/IHEC/2020–21/01），并续期为（CSIR-IGIB/IHEC/2020–21/02）。在纳入研究前，已从所有参与者（16岁以下儿童的父母或法定监护人）处获得书面知情同意。

最初共从德里Saket区Max超级专科医院招募57名个体，包括健康对照（n = 9）、qRT-PCR确诊的COVID-19患者（n = 24）以及在两个恢复阶段的恢复个体样本：基线恢复（时间点1：Recovered_T1，n = 16）和随访恢复（时间点2：Recovered_T2，n = 8；约在第1个时间点后的3个月）。Recovered_T2组代表对Recovered_T1队列中部分个体进行的纵向随访采样，而非独立的参与者组。经过质量控制和样本级别筛选后，保留了44个样本用于下游分析，包括健康对照（n = 9）、感染个体（n = 14）、Recovered_T1（n = 15）和Recovered_T2（n = 6）。因此，最终数据集既包括健康、感染和恢复状态之间的横断面比较，也包括部分恢复个体的纵向随访样本。详细的参与者级别分布（包括相应的采样时间点）见附表S1和图1A；附表S1总结了研究队列的人口学和临床特征，包括年龄、性别、合并症、SpO2和CRP水平。研究组中既有男性也有女性代表；然而，由于样本量有限，未单独评估性别特异性效应。

方法详情

PBMC分离

对每位参与者，从肘静脉采集5 mL静脉血于EDTA管中。使用Histospace-1077（Sigma-Aldrich）密度梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMC）。全血用等体积PBS（1:1）稀释后，铺于50 mL锥形管中10 mL Histopaque上，然后在室温下以400 × g离心20分钟，不施加制动。小心收集血浆-Histopaque界面的PBMC层，用无菌PBS洗涤两次（400 × g，10分钟），重悬于冻存培养基（90% FBS，10% DMSO）中。细胞在-80°C异丙醇冷冻器中低温保存24小时后转移至液氮中长期储存。

单细胞文库构建与测序

从液氮中取出冷冻PBMC，在异丙醇冷冻器中逐步解冻至约25°C，然后在37°C水浴中短暂孵育（约2分钟）完成解冻。细胞立即用预热的含2%胎牛血清（FBS）的PBS稀释，调整至最终体积10 mL，并在室温下以400 × g离心5分钟。所得沉淀重悬于PBS+2% FBS中，通过40 μm细胞滤器（Corning）过滤，并用台酚蓝排除法计数活细胞。

每个样本约20万个细胞，按照制造商说明使用BD Single-Cell Multiplexing Kit-Human（Cat. No. 633781）和50个BD AbSeq抗体-寡核苷酸偶联物进行染色。经两次洗涤去除未结合的试剂后，计数细胞，重悬于推荐缓冲液中，并进行捕获准备（每个样本约6,000个细胞，每批处理四个）。在BD Rhapsody Express单细胞分析系统上进行单细胞捕获，将细胞分配到微孔中。裂解后，释放的mRNA与包被oligo (dT)的珠子杂交，通过逆转录生成带有唯一分子标识符（UMI）的条形码cDNA分子（Cat. No. 633773）。

使用BD Rhapsody全转录组扩增（WTA）试剂盒（Doc ID: 210967 Rev. 1.0）构建cDNA文库。该过程包括随机引物、延伸和加索引。同时，从捕获珠子上洗脱Sample Tag和AbSeq寡核苷酸，进行扩增和加索引。最终文库使用Qubit 4.0荧光仪（Invitrogen，美国）定量，并使用Bioanalyzer（Agilent，Cat. No. 5067–4626）评估片段大小。WTA、Sample Tag和AbSeq文库合并后在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序。WTA文库测序深度约为每个细胞30,000条reads（85 bp Read1，251 bp Read2），Sample Tag和AbSeq文库测序深度分别为每个细胞每标签约360条reads和每个细胞约500条reads（51 bp Read1，75 bp Read2）。

单细胞RNA-seq数据处理

Illumina原始碱基调用文件（*.bcl）首先使用bcl2fastq2（v2.19.0.316）转换为FASTQ格式，然后根据文库构建期间使用的样本特异性标签进行去混洗。使用Trimmomatic（v0.39）评估reads质量，去除Phred质量值<30的低质量reads。过滤后的reads使用STARsolo比对至人类参考基因组grch38。从最初招募并处理的57个样本中，共捕获了191,417个细胞。经过质量控制筛选（包括保留>200 UMI且线粒体reads<20%的细胞）后，保留156,151个细胞。为确保数据集的稳健性，排除贡献少于500个细胞的样本，最终数据集包括44个样本和153,075个高质量细胞。其中包括健康对照（n = 9）、感染患者（n = 14）、第一个恢复时间点的恢复个体（Recovered_T1，n = 15）以及恢复后约3个月采样的纵向子集（Recovered_T2，n = 6）。重要的是，Recovered_T2代表Recovered_T1队列的纵向子集，而非独立组别。下游分析使用Seurat R包（版本5）进行。在整合前，每个样本作为单独的Seurat对象进行处理。首先使用SCTransform对基因表达数据进行归一化，以校正技术变异。使用典范相关分析（CCA）通过Seurat中的FindIntegrationAnchors和IntegrateData工作流程校正样本间的批次效应，该方法基于相关基因表达特征将数据集对齐到共享的低维空间中。整合后，在校正后的表达矩阵上使用主成分分析（PCA）进行降维。前若干主成分用于下游分析。聚类使用基于共享最近邻（SNN）图的方法进行，并评估多个分辨率（0.3–0.6）以识别稳定且具有生物学意义的一致性聚类。使用均匀流形近似与投影（UMAP）对聚类进行可视化。使用Wilcoxon秩和检验（FindAllMarkers）确定定义每个聚类的差异表达基因，log2 fold-change阈值为1.5，p < 0.05。对于细胞类型注释，聚类特异性标志基因使用EnrichR进行过度代表性分析（ORA），参考数据库包括CellMarkerDB、Azimuth和PanglaoDB。将这些结果与AbSeq抗体面板（n = 50）整合，并通过CellMarker DB和PanglaoDB进行手工优化，最终识别出13种免疫细胞群体。

对于细胞组成分析，通过归一化每个样本的细胞总数来计算每种免疫细胞类型的比例。这确保了跨条件的比较基于相对细胞类型丰度而非绝对细胞计数，从而考虑了样本间测序深度和总细胞数的变异性。统计比较使用这些样本级别的比例进行。

差异基因表达和基因集富集分析

为下游分析，我们创建了两组样本分组。第1组包括健康、感染和基线恢复（T1）个体，在这些条件之间进行两两比较。第2组由纵向采样的恢复个体组成，其中6个基线恢复（T1）样本直接与各自的随访恢复（T2）样本进行比较。

两组的差异基因表达（DGE）分析均使用Seurat的FindMarkers函数，采用Wilcoxon秩和检验。校正后p值（p-adj ≤0.05）的基因被视为显著差异表达。所得的排名基因列表用于基因集富集分析（GSEA）。富集分析使用fgsea R包，以分子特征数据库（MSigDB）hallmark基因集集合作为参考。此外，纳入血液转录模块（BTMs）以捕获外周血中的免疫特异性转录程序。为减少背景噪声并避免虚假富集信号，在分析前从参考基因集（gmt）文件中去除数据集中未检测到的基因。随后使用ggplot2可视化标准化富集评分（NES）、基因比率和显著性值。

基因特征评分

为评估免疫反应的强度，我们从公开参考资料中精选了代表细胞因子、趋化因子和白介素反应的基因模块（附表S8）。使用Seurat中的AddModuleScore函数在单细胞水平计算基因特征评分，该函数计算每个细胞中每个基因集的平均表达量，同时校正匹配的基因表达背景。对于统计分析，特征评分在各注释细胞类型内进行汇总，并在两个分析框架（第1组：健康、感染和恢复；第2组：Recovered_T1与Recovered_T2的纵向比较）定义的条件之间进行比较。

组间差异通过对这些细胞类型分层分布进行Wilcoxon秩和检验进行评估，确保比较在生物学上定义的免疫亚群内部进行，而非在异质性细胞群体之间进行。该策略能够在定义的细胞类型水平上解析免疫通路活性，同时保持每种条件下样本的代表性，从而捕捉群体内的异质性和条件特异性的免疫活性变化。该方法特别适用于免疫区室标注良好的数据集，在这种数据集中，保持细胞类型特异性对于生物学解释至关重要。

**细胞间通讯分析**

为了探究免疫细胞在感染和恢复期间如何相互作用，我们使用ICELLNET v2 R包进行了细胞间通讯分析。该框架基于一个手工策划的包含超过1,600个人源配体-受体相互作用的数据库，考虑了多亚基受体和配体复合物的复杂性。在本研究中，我们以先天免疫细胞（包括树突状细胞、单核细胞和自然杀伤细胞）作为核心的信号发送/接收群体，并考察它们与适应性免疫细胞（包括我们在数据集中鉴定的初始CD4+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、调节性T细胞、NK T细胞、记忆T细胞、B细胞和浆细胞）之间的通讯。

分析基于SCTransform处理的Seurat对象生成的标准化表达矩阵进行。仅保留在两种相互作用细胞类型中均有可测量表达的配体-受体对，以确保生物学上相关的预测。随后计算通讯评分，并使用InterCellar可视化工具绘制相互作用网络，该平台提供了映射预测相互作用强度和方向的交互式平台。这使我们能够突出先天免疫和适应性免疫亚群之间的关键通讯轴，并确定与疾病状态相关的免疫交叉对话潜在变化。

**拟时序轨迹分析**

为了捕捉T细胞状态内的动态变化并重建潜在的谱系进展，我们使用R中的Monocle 3包进行了拟时序分析。该分析专门针对T细胞，这些细胞首先从包含全部13种免疫细胞类型的Seurat对象中提取。在Seurat中完成预处理、整合和聚类后，将标准化表达数据和T细胞亚型注释转入Monocle 3对象进行轨迹推断。

随后使用learn_graph()函数构建主轨迹图。为确保所有T细胞状态之间的连续性并避免分区特定的子轨迹，我们设置了use_partition = TRUE。这使我们能够检测到分支点和替代发育途径，反映T细胞反应的异质性。使用plot_cells()函数在UMAP嵌入上进行轨迹可视化，并叠加Seurat衍生的T细胞簇以进行更清晰的生物学解释。

通过调整label_principal_points参数对根节点、终末状态和分支节点进行注释。根据各自在T细胞分化中的生物学作用，每个独特的谱系分支都独立地被赋予来自健康状态下初始细胞或前体细胞的根节点。健康状态下的初始CD4+ T细胞被作为CD4+ T细胞和记忆T细胞谱系的根细胞，健康状态下的CD8+ T细胞被作为细胞毒性谱系的根细胞，健康状态下的调节性T细胞被作为调节性T细胞谱系的根细胞。随后使用order_cells()函数对每个独特子图中的细胞进行排序。对于拟时序动态的统计分析，拟时序值在样本水平上按每个T细胞亚型进行汇总（假bulk方法）。随后使用适当的非参数统计检验对组1（健康、感染、恢复）和组2（恢复_T1与恢复_T2比较）进行组间比较。该方法确保统计推断反映的是生物学重复而非单个细胞水平的变异。

**定量与统计分析**

每个样本中免疫细胞群体的比例进行了标准化，以考虑总细胞计数和测序深度的变化，条件间差异通过Fisher精确检验计算。使用Wilcoxon秩和检验分析和比较标注免疫细胞的基因特征评分在不同条件下的差异（组1：健康、感染、恢复；组2：恢复_T1与恢复_T2比较）。对于拟时序分析，使用假bulk方法在每个T细胞亚型中按样本水平计算拟时序。使用适当的非参数检验进行组间比较，这帮助我们确保统计推断是基于生物学重复而非单个细胞进行的。所有统计分析和显著性检验均使用GraphPad Prism和R完成。

**补充信息（9）**

下载全部 PDF（2.09 MB）文档S1. 图S1–S11
电子表格（72.61 KB）表S1. 研究参与者的临床和人口统计学特征
电子表格（169.56 KB）表S2. 健康组、感染组和恢复组之间先天和适应性细胞类型的细胞因子、趋化因子和白介素基因表达比较（配对Wilcoxon符号秩检验，Bonferroni校正）（组1）
电子表格（35.88 KB）表S3. 细胞间通讯分析中识别出的健康组、感染组和恢复组之间的前20个配体-受体相互作用对（组1）
电子表格（156.76 KB）表S4. 细胞间通讯分析中富集的细胞间信号通路（跨健康组、感染组和恢复组）（组1）
电子表格（157.99 KB）表S5. 恢复_T1和恢复_T2组之间先天和适应性细胞类型的细胞因子、趋化因子和白介素基因表达比较（配对Wilcoxon符号秩检验，Bonferroni校正）（组2）
电子表格（84.99 KB）表S6. 早期和晚期恢复期细胞间通讯分析中识别出的前20个配体-受体相互作用对（组2：恢复_T1与恢复_T2比较）
电子表格（125.29 KB）表S7. 早期和晚期恢复期细胞间通讯分析中富集的细胞间信号通路（组2：恢复_T1与恢复_T2比较）
电子表格（71.80 KB）表S8. 用于细胞因子、趋化因子和白介素模块评分的参考基因集