古基因组学揭示德国北部法尔沃德古代晚期墓葬遗址中存在麻风病病例

《iScience》：Paleogenomics reveals leprosy at the late antique burial site of Fallward in northern Germany

　　

摘要
从铁器时代和迁徙时期德国北部的人类基因组分析中
一名感染麻风杆菌的男性被安葬，随葬品与罗马相关
他展现出与罗马多瑙河边疆地区人群的遗传亲和力
研究结果揭示了罗马势力范围的广泛影响以及远距离的人口流动

摘要
位于德国西北部（公元3至5世纪）的沿海定居点Fallward以异常保存完好的木质和纺织随葬品而闻名，但其居民的遗传特征和病原体情况一直未受到研究。我们对来自11个个体的骨骼样本进行了宏基因组分析，以探讨其遗传亲和力及传染病历史。其中三人的数据足以进行群体遗传分析：两人聚类于西北欧铁器时代与盎格鲁-撒克逊群体，而一名成年男性可能源自罗马边疆人口。该男子同时感染了属于系统发育分支4的一种麻风分枝杆菌毒株，并被埋葬于一条船棺中，随葬品包含受罗马影响之物，如雕刻家具和军用腰带。这些发现共同表明，可能存在的远距离联系在晚古时期将像Fallward这样的偏远社区与更广阔的罗马世界连接起来。

图形摘要

引言
Fallward考古定居点位于当今德国西北部的易北河-威悉河三角区。它建立在一座人工居住土丘之上，这种土丘被称为terp或wurt，构筑在一条与北海海岸平行的天然海滩脊的沙质和砾石丰富沉积物上（图1）。在当时堤坝尚未修建的年代，这些土丘为人们提供了抵御风暴潮、高潮和洪水的栖身之地——这些是海洋环境不可预测的常见威胁。尽管面临这些外部危险，周围沼泽地的肥沃土壤使得农业既可行又有利可图。Fallward是易北河-威悉河三角区在公元前1世纪建立的八个定居点之一（图1）。初步考古调查在该遗址发现了多个不同的土丘抬升和居住阶段。然而，该定居点在公元5世纪期间逐渐衰落，可能在该世纪末完全被遗弃。这一时期也在北海海岸带的许多邻近区域见证了定居活动的明显减少，这一趋势通常与同时期书面资料中记录的向不列颠的迁徙有关。与此一致，最近的古基因组研究揭示了来自大陆北欧人对英国早期盎格鲁-撒克逊基因库的显著渗入。

图1 展示居住土丘Fallward及德国西北部另外七个土丘位置的地图
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红圈标示了居住土丘遗址的位置。它们沿古代海岸线（以线标示）建造。斜线区域表示公元4至5世纪时的沼泽地。

20世纪90年代进行的发掘工作揭露了Fallward定居点附近的一处墓地，该墓地在Fallward使用的最后阶段——从公元3世纪末到5世纪末——一直被使用。这些年代属于北欧考古学所定义的晚期罗马铁器时代和迁徙时期。该墓地包含约200座火葬墓和60座土葬墓。尤其在遗址的西北部，许多墓穴被深掘至化石沼泽黏土中。在这些持续潮湿的条件下，各种材质的随葬品得以异常完好地保存下来。除了不同种类的棺木外，出土文物还包括用植物材料、毛皮和纺织品制成的床垫或衬垫及覆被；多层衣物布料及相关配饰；由木材和陶瓷制成的家用器具部件；以及一些装饰精美的家具（图2A至2C）。

图2 船葬及其相关陈设（来自第265号墓）
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第265号墓中的男子被安葬在一条长逾四米的船中，该船被木板覆盖，形成类似屋顶的结构（A）。墓中还包含一把由桤木树干制成的精美椅子（B）以及一张足凳，其底部刻有狩猎场景（C），此物在罗马帝国境内有大量可比实例（照片：R. Kiepe，下萨克森历史海岸研究所）。

得益于其异常完好的保存状况，Fallward的随葬品被列为中欧晚期铁器时代和迁徙时期最重要的墓葬发现之一。它们为了解当时北海海岸居民的日常生业、丧葬习俗和社会文化组织提供了宝贵洞见。墓葬遗址及其为逝者选取的随葬品，似乎反映出一个高度注重传统、基本安土重迁的社会。一些特别丰富的墓葬中含有外来物品，主要来自地中海地区，以往被视为与特权地位相关。

尽管该遗址意义重大，但Fallward的人类遗骸尚未接受古基因组方法的研究。因此，关于该墓葬社区遗传构成的问题一直悬而未决。为填补这一空白，我们对来自11个个体的骨骼样本进行了宏基因组分析。我们的调查重点是探索这些个体与欧洲同期人群之间的遗传亲和力。

结果
基因组分析揭示了一个个体可能存在非本地祖先的证据

在本研究中，我们从位于德国Fallward居住土丘定居点附近安葬的11个个体的12个骨骼样本中提取了DNA（表1）。DNA提取物接受了鸟枪法测序。对于八位个体，可确定其遗传性别。我们识别出七名男性和一名女性（表1；图S1）。对于三位骨骼学和遗传性别评估均可用的成年人（G14、G265和G407），各方法结果一致。对于三位具有遗传和考古性别判定的儿童，一位显示结果一致（G250），而另外两位则不一致（G224和G282）（表1）。由于基因组覆盖度低，无法研究Fallward群体内部的亲属关系。

个体来自墓号 | 骨骼元素 | 死亡年龄（岁）a | 骨骼学性别a | 考古学性别a,b | 遗传性别
G14 | 岩骨 | 成人 | M | M | M
G223 | 岩骨 | 儿童 | – | ? | M
G224 | 岩骨 | 儿童 | – | F | M
G250 | 岩骨 | 3 | F | F | F
G265 | 跟骨、磨牙 | 50 | M | M | M
G282 | 岩骨 | 1.5 | ? | F | M
G284 | 股骨 | 45–55 | F | F | –
G407 | 股骨 | 40 | M | M | M
G439 | 股骨 | 成人 | – | ? | –
G452 | 股骨 | 成人 | F | F | –
G468 | 股骨 | 儿童 | – | ? | M

表1 本研究分析的Fallward个体
a 死亡年龄及骨骼学/考古学性别如先前所报告。
b 考古学性别判定基于随葬品类型。对于标粗体显示者，可执行群体遗传分析。M = 男性，F = 女性，– = 无法分析，? = 性别不确定。
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三个样本产生了质量足以进行群体遗传分析的数据（G14、G250和G265）。在主成分分析（PCA）图中，G14和G250聚类于现今西北欧人种观察到的变异范围内（图3）。相比之下，G265则沿着与东南欧人群相关的遗传梯度分布（图3），表明其可能有不同的祖源背景。将Fallward个体投影到包含古代参考人群的PCA上，显示G14和G250最接近铁器时代和早期中世纪群体，特别是表现出对英国铁器时代个体而非德国铁器时代个体更大的亲和力（图4）。G265则与来自中欧和南多瑙河边疆地区的罗马铁器时代和迁徙时期个体（克罗地亚、斯洛文尼亚、匈牙利和塞尔维亚）聚类（图4）。围绕500年CE进行遗传亲和力的时空插值——对应G265的大致考古年代——确定了多个相似度概率升高的区域，包括南斯堪的纳维亚，尽管最高值跨越了中欧东部，另有一个次要热点位于黑海-里海草原（图5）。最高概率位置位于Fallward东南方向超过1400公里处，靠近罗马边疆（图5）。与这些结果一致，个体G265携带Y染色体单倍群G，这一谱系现今主要见于高加索地区，尽管在欧洲其他地区也以较低频率出现（表S1）。然而，补充分析（外群f3和f4统计量、无监督混血分析及qpAdm建模）并未识别出可将G265与其他Fallward个体区分开的离散祖源谱系（图S2至S4；表S2）。

图3 三名Fallward个体投影到现代西欧亚人群遗传变异上的主成分分析
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轴标签指示每个主成分解释的变异比例。

图4 Fallward个体以及已发表的铁器时代、迁徙时期和中世纪样本的主成分分析
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（A）古代个体被投影到现今西欧亚人群的变异上（浅灰色）。（B）古代样本所占空间的放大视图。轴标签指示每个主成分解释的变异比例。
缩写：IA，铁器时代。

图5 使用mobest对G265在500年CE左右进行遗传亲和力的时空插值
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颜色表示基于前三个主成分在整个研究区域内的遗传相似度插值概率。红圈标示Fallward的位置，黄色三角标示插值概率面的最大值位置。虚线表示根据罗马帝国数字地图集重构的罗马边疆大致轮廓。

来自Fallward的古代麻风病基因组揭示早期分支4的多样性

宏基因组病原体筛查显示G265的两个样本（牙齿和跟骨）中存在麻风分枝杆菌DNA。为研究这些麻风分枝杆菌读取序列，采用麻风分枝杆菌TN参考基因组（美国国家生物技术信息中心[NCBI] RefSeq: NC_002677.1）进行了比对。比对统计数据显示参考基因组覆盖度高，4倍覆盖率超过99%，平均深度为58.3（表S3）。此外，对对齐读取序列观察到的去氨基化模式具有古代DNA特征（图S5）。

随后，我们构建了一棵包含44个古代和185个现代麻风分枝杆菌毒株的系统发育树，代表了所有主要分支（图6）。该树显示G265的麻风分枝杆菌基因组是已知分支4多样性的祖先，仅被来自埃及木乃伊的Abusir1630早于（图6）。随后对G265麻风分枝杆菌毒株进行单核苷酸多态性（SNP）效应分析，识别出八个高影响SNP（表S4），其中七个为移码突变，一个导致提前终止密码子。尽管预测这些变异会严重破坏蛋白质功能（例如通过截断、功能丧失或无义介导降解），但它们在古代和现代毒株中的广泛存在表明，它们并非G265毒株特有的新发破坏事件。

图6 基于3124个单核苷酸多态性构建的麻风分枝杆菌最大似然树
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该树以麻风分枝杆菌外群根化。图例颜色指示对应分支。仅包含现代毒株的分支已折叠。古代毒株显示相应日期和国家名称缩写（缩写列表见表S6）。G265以红色标示。用于构建系统发育树的基因组列于表S6。比例尺代表每个位点的核苷酸替代数。自展值大于70%以数字形式显示在分支节点上。

接着，我们研究了已知的麻风分枝杆菌毒力因子。我们检验了毒力因子数据库中列出的所有麻风分枝杆菌特异性基因。G265毒株对所有160个基因的覆盖率超过95%（表S5）。特别是，它在与VII型分泌系统相关的几个基因（包括ecc、esp和esx基因，；表S5）、85抗原复合物（fbpA、fbpB和fbpC，；表S5）以及酚性糖脂的产生（pks15/1、mas、fadD、pap和ppsA-E，，；表S5）方面均表现出高覆盖率。

讨论

在本研究中，我们对来自德国西北部Fallward居住土丘附近安葬的11个个体的骨骼样本进行了宏基因组分析。该墓地以其异常完好保存的木质和纺织材料而闻名，是罗马铁器时代至迁徙时期中欧最重要的墓葬遗址之一。相比之下，提取的人类DNA质量和数量相对较差。也注意到，麻风分枝杆菌基因组的保存状况明显优于宿主体内生DNA。细菌读取序列的数量远超人类读取序列，这一现象此前已有报告。这种差异可能归因于分枝杆菌富含脂质的细胞壁，它可能提供更好的抗死后降解保护。

对于四位个体，遗传结果与骨骼学性别判定一致，并与相应的随葬品相符（表1；图S1）。

两名儿童个体G282和G224在基因推断的男性性别与其墓葬组合所暗示的性别之间出现了不一致，这些墓葬组合中包含别针和珠子等通常被解读为与女性相关联的随葬品。这些不一致凸显了将随葬品与生物学性别直接等同的局限性，尤其是在儿童中，其性别角色和社会身份可能并未被严格定义或在丧葬实践中一致地表达。此外，这些随葬品也可能反映了家庭、象征性或仪式方面的因素，而非死者的生物学性别。然而，考虑到这些个体的基因组覆盖率较低且损伤信号减弱，对其基因性别判定的解释应持谨慎态度。

所有三个能够产生足够数据的个体（G14、G250和G265）的基因组与同时期欧洲人群聚簇（图3）。尤其值得注意的是，G14和G250落在现今西北欧所观察到的变异范围内，与盎格鲁-撒克逊人（公元450—1066年；图4）关系密切。这一发现可能表明，他们的亲属或后裔（对于G14而言）可能参与了对北海彼岸大不列颠群岛的迁徙。与之相反，G265是一位估计约50岁的成年男性，与多瑙河流域边疆省的罗马铁器时代和大迁徙时期个体聚簇（图4），表明其与中东欧东部地区的人群存在遗传关联（图5）。他在Fallward附近的埋葬位置表明，他本人或其近亲可能起源于埋葬地点东南方向的某个地区，可能位于更广泛的多瑙河边疆地区，随后迁徙至Fallward。然而，由于补充分析缺乏足够的分辨率来确定其确切的遗传起源，这一解释应谨慎对待。

在公元5世纪20年代去世时，G265感染了麻风分枝杆菌（M. leprae），尽管其骨骼遗骸未显示任何麻风病特异性病变。重建的细菌基因组属于第4分支，该分支最早已知的代表可追溯至公元前4世纪至公元前2世纪的埃及。通过SNP效应分析，我们未发现独特的高影响SNP。G265菌株对已知的麻风分枝杆菌所有毒力因子均表现出高覆盖率。麻风病是一种慢性疾病，可能需要数年才会发展。骨病变的表观缺失可能表明G265受到了无症状型麻风病的影响。另一种可能性是，他在软组织上出现症状，但在骨骼上没有炎症。无论如何，他可能死于不相关的继发原因。

除了感染第4分支的麻风分枝杆菌菌株外，G265因其随葬品的独特性质而尤为引人注目。该男子被安葬在一艘长达四米以上的橡树（Quercus）船棺中，船棺顶部被仔细密封成类似屋顶的结构（图2A）。这艘船棺表明，在他生前可能与附近的河流或周边海洋环境有密切的联系。这一解释得到了他身上所铺的芦苇席、船棺内发现的数根鱼骨以及一个形似水鸟的小盒子的支持。骨骼学分析进一步显示，该男子的上臂肌肉异常发达。综合以上线索，可能指向他经常作为船夫或渔民从事活动。船棺外部放置了一把山毛榉（Alnus）制成的块状椅子，椅身装饰有凹槽雕刻，据推测曾被涂漆（图2B）。这把椅子常被解读为"宝座"，被视为权威或权力的明确象征。在死者脚部位置放置了一张枫树（Acer）制成的小凳，上面绘有狩猎场景并刻有卢恩符文铭文（图2C）。此外，墓葬中还包括一张游戏桌、一个青铜盆和一个陶瓷容器等物品。这些物品显示出明显的使用和修复痕迹，表明它们都不是专门为葬礼制作的，而更可能是该男子本人或其直接的私人或家庭环境中的物品，为了解其生活和日常生活提供了宝贵见解。

物品的数量和质量被认为是反映该个体在当地社区中享有特权地位和物质财富的体现。尽管考古植物学分析结果表明仅使用了本地木材，但这些物品的多样化且精致的装饰显然反映了晚期古典艺术与工艺的影响。墓中发现的一根系带军带进一步强调了其与罗马帝国的联系，强化了他本人或其祖先可能来自受罗马影响地区的这一可能性。假设性地说，他可能是一名同盟军士兵（foederatus）——一名在罗马军队中服役的雇佣兵，后来在大西洋西北部的这个地区寻求新的家园。然而，这条军带本身并不一定意味着罗马军事服役，因为此类物品也可能通过贸易、继承或战利品获得。

总之，Fallward墓葬的综合考古学与人类/病原体基因组研究发现凸显了个体生平经历的复杂性。尽管G265的确切起源仍未明确，但现有证据提出了在晚罗马时期和大迁徙时期，西北德意志地区存在远程联系的可能性。

研究局限性
部分样本表现出较低的基因组覆盖率和减弱的末端脱氨信号（表S1），降低了部分分析的可信度。这对G224和G282尤为相关，其基因性别判定与骨骼学或考古学评估结果不同，因此应谨慎解释。对于群体遗传学分析，仅三个个体（G14、G250和G265）产生了质量足够的基因组数据，尽管在1240K芯片上的SNP覆盖率仍相对较低（覆盖32,000–67,000个SNP；表S1）。这限制了比较分析的分辨率，尤其是针对G265祖先来源和可能地理起源的评估。相应地，qpAdm建模不支持相对于Fallward另外两个个体的G265具有独特祖先模型，因为基于北部和中欧铁器时代及大迁徙时期人群的多个单方向模型均无法被排除，而双方向模型通常不可行（表S2）。这可能反映了候选来源人群之间的密切遗传相似性以及可用外群分辨率的有限性，再加上Fallward基因组SNP覆盖率的较低进一步加剧了这一局限。G14和G265表现出比G250更低的末端C到T错误掺入水平（图S6）。尽管古代样本中脱氨水平的显著变异是预期之中的，且尚未确立普遍接受的死后损伤阈值，但较低的基因组覆盖率与较弱的损伤模式相结合，要求对呈现的群体遗传学结果持谨慎解释态度。最后，由于这些分析仅基于三个个体，发现结果应视为个体案例研究，可能无法反映更广泛Fallward社区的遗传多样性。

资源可用性
主要联系人
有关进一步信息和资源的请求应提交给主要联系人Ben Krause-Kyora（[e-mail]），由其负责提供。

材料可用性
本研究未产生新的独特试剂。本研究分析的人骨骼材料由相关收藏机构保管。标本的获取权限由收藏机构及相关研究人员（包括合著者S.G.-P.（Ossatura，布伦瑞克）、H.J.和C.P.（下萨克森历史海岸研究所，威廉港））授予。希望获取这些馆藏的研究人员应直接联系相关收藏机构和合著者。

数据和代码可用性
- 本研究产生的原始测序数据已提交至欧洲核苷酸档案（ENA：PRJEB101719），并在发表之日起公开可用。
- 本文未报告原创代码。
- 重新分析本文报告数据所需的任何其他附加信息，可通过请求向主要联系人索取。

致谢
本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）在德国卓越战略框架下资助（项目号ROOTS EXC 2150 390870439）。D.A.M.获得德国石勒苏益格-荷尔斯泰因州颁发的博士研究生奖学金资助。

作者贡献
概念构思：A.N.和B.K.-K.；数据整理：D.A.M.和N.A.d.S.；形式分析：D.A.M.、N.A.d.S.和J.H.R.-D.；资金获取：B.K.-K.；调查：D.A.M.、N.A.d.S.、C.P.、H.J.、A.N.和B.K.-K.；项目管理：A.N.和B.K.-K.；资源：S.G.-P.、H.J.和C.P.；监督指导：A.N.和B.K.-K.；可视化：D.A.M.和N.A.d.S.；初稿撰写：A.N.、D.A.M.、N.A.d.S.、C.P.和B.K.-K.；修订和编辑：D.A.M.、N.A.d.S.、J.H.R.-D.、S.G.-P.、H.J.、C.P.、A.N.和B.K.-K.。所有作者均审阅了论文并批准提交决定。

利益声明
作者声明不存在利益冲突。

STAR★方法
关键资源表

试剂或资源 | 来源 | 标识符
生物样本 | 人类考古遗骸 | 本研究 | G14
生物样本 | 人类考古遗骸 | 本研究 | G223
生物样本 | 人类考古遗骸 | 本研究 | G224
生物样本 | 人类考古遗骸 | 本研究 | G250
生物样本 | 人类考古遗骸 | 本研究 | G265
生物样本 | 人类考古遗骸 | 本研究 | G282
生物样本 | 人类考古遗骸 | 本研究 | G284
生物样本 | 人类考古遗骸 | 本研究 | G407
生物样本 | 人类考古遗骸 | 本研究 | G439
生物样本 | 人类考古遗骸 | 本研究 | G452
生物样本 | 人类考古遗骸 | 本研究 | G468
已存数据 | 测序数据 | 本研究 | ENA: PRJEB101719
软件和算法
Clip&Merge v1.7.8 | Peltzer等人 | https://github.com/apeltzer/ClipAndMerge
BWA v0.7.15 | Li和Durbin | https://github.com/lh3/bwa
DeDup v0.12.1 | Peltzer等人 | https://github.com/apeltzer/DeDup
bamUtil v1.0.15 | Jun等人 | https://github.com/statgen/bamUtil
SAMtools v1.12 | Li等人 | https://www.htslib.org/
DamageProfiler v.1.1 | Neukamm等人 | https://github.com/Integrative-Transcriptomics/DamageProfiler
Schmutzi v1.5.5.5 | Renaud等人 | https://github.com/grenaud/schmutzi
ANGSD v0.935 | Korneliussen等人 | https://github.com/ANGSD/angsd
HapCon v0.64 | Huang和Ringbauer | https://github.com/hringbauer/hap
HaploGrep2 v2.4.0 | Weissensteiner等人 | https://github.com/seppinho/haplogrep-cmd
yHaplo v1.1.2 | Poznik | https://github.com/23andMe/yhaplo
SequenceTools v1.2.2 | Schiffels和Peltzer，2023 | https://github.com/stschiff/sequenceTools
Allen古代DNA资源（AADR），版本62.0 | Mallick等人 | https://dataverse.harvard.edu/dataset.xhtml?persistentId=doi:10.7910/DVN/FFIDCW
smartpca v16000 | Patterson等人 | https://github.com/DReichLab/EIG
qp3Pop v650 | Patterson | https://github.com/DReichLab/AdmixTools
qpDstat v970 | Patterson等人 | https://github.com/DReichLab/AdmixTools
ADMIXTURE v1.3.0 | Alexander等人 | https://dalexander.github.io/admixture/
PLINK v1.90b6.21 | Purcell等人 | https://www.cog-genomics.org/plink/
qpAdm v1201 | Patterson等人 | https://github.com/DReichLab/AdmixTools
mobest v1.0.0 | Schmid和Schiffels | https://github.com/nevrome/mobest
MALT v0.4.1 | V?gene等人 | https://uni-tuebingen.de/fakultaeten/mathematisch-naturwissenschaftliche-fakultaet/fachbereiche/informatik/lehrstuehle/algorithms-in-bioinformatics/software/malt/
MEGAN6 v6.25.9 | Huson等人 | https://uni-tuebingen.de/fakultaeten/mathematisch-naturwissenschaftliche-fakultaet/fachbereiche/informatik/lehrstuehle/algorithms-in-bioinformatics/software/megan6/
IGV v2.17.1 | Robinson等人 | https://igv.org/
BLAST v2.15.0 | Altschul等人 | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome
BCFtools v1.12 | Li | https://www.htslib.org/
filterSAM v0.0.11 | Robaina-Estévez | https://github.com/Robaina/filterSAM
RAxML v8.2.12 | Stamatakis等人 | https://cme.h-its.org/exelixis/web/software/raxml/
iTOL v6 | Letunic和Bork | https://itol.embl.de/
SnpEff v5.2f | Cingolani等人 | https://pcingola.github.io/SnpEff/
VFDB | Liu等人 | https://www.mgc.ac.cn/VFs/

实验模型和研究参与者详情

考古背景
本研究完全遵循历史人遗骸DNA研究的伦理原则进行。未从在世个体或其他现代人类遗骸中产生基因组数据。

作为人类学调查的一部分，从1995年至1998年间发掘的11个个体的安葬墓葬骨骼遗骸中收集了12个样本。由于所有墓葬均为单人安葬，骨骼遗骸可以明确归属于特定个体。

死者身着衣物被安葬，深度可达两米，并伴有大量由各种有机和无机材料制成的随葬品。这些保存异常完好的随葬品表明墓葬年代可追溯至公元4至5世纪。部分墓葬在野外直接进行观察和记录（G223、G224、G439、G452、G265、G468），其余则以完整土块形式回收，随后在实验室条件下进行发掘（G14、G250、G282、G284、G407）。

许多随葬品根据其各自材质进行了修复保存，现陈列于博物馆展出。然而，人类骨骼遗骸则一直存放于库房中，直到近期进行人类学分析为止。目前，Fallward墓葬遗址正在德国研究基金会（DFG）资助的跨学科研究项目框架下重新检查和评估。

方法细节

样品处理和测序
遵循已发表的指南，所有实验室工作均在基尔大学古代DNA实验室的洁净室内进行。使用前和使用后对所有表面均用次氯酸钠和/或核酸清除试剂进行彻底清洁。同时，使用紫外线消毒对所有工作区进行消毒。在整个实验过程中，实验室工作人员穿着防护服、戴着手套和口罩。所有化学品和试剂均不含DNA酶、RNA酶和热原质，且仅使用过滤移液器吸头。12个样品按先前描述的方法进行了制备和研磨。最后，使用此前建立的方法提取DNA。

采用先前研究中概述的方法，生成了双链、半UDG（尿嘧啶DNA糖苷酶）处理的文库。这些文库在基尔大学临床分子生物学研究所使用Illumina NovaSeq 6000平台（2 × 100 bp）进行鸟枪法测序。原始测序reads随后使用Clip&Merge v1.7.8（默认设置）进行处理，去除接头并将正向和反向序列合并，其中包含一个过滤步骤，保留至少25bp的reads。

量化和统计分析

比对到人类参考基因组
测序reads使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）aln v0.7.15比对到hg19人类参考基因组，参数针对古代DNA进行了优化（宽松错配设置：-n 0.01，禁用种子序列：-l 300）。使用DeDup v0.12.1去除PCR重复序列。除非另有说明，所有下游分析均基于使用bamUtil v1.0.15去除末端两个碱基的reads，并使用SAMtools v1.12将最低碱基质量和比对质量过滤为30。

部分分析使用了未经修剪和比对质量过滤的BAM文件，这些文件在后续章节中被称为"未过滤"文件。比对统计数据见表S1。古DNA认证通过DamageProfiler v1.1评估死亡后损伤模式，并使用Schmutzi v1.5.5.5根据线粒体DNA（mtDNA）估算污染水平，两者均在未过滤的BAM文件上进行。使用ANGSD v0.935和HapROH包中的HapCon v0.64评估男性个体中X染色体的污染。对于HapCon，使用了1000 Genomes参考面板，基于少于1000个目标位点的估计被认为不可靠，因此予以排除。脱氨图谱见图S6。污染估计结果见表S1。对于样本G265，来自两个骨骼元素（跟骨和牙齿）的四个文库提供了测序数据。当所有文库合并使用时，HapCon获得的污染估计值偏高。因此，仅保留单个文库——跟骨中覆盖度最好的数据集——用于下游人群遗传学分析，因为它在独立评估时似乎未受污染。然而，对于后续病原体分析，使用了全部四个文库，因为它们与麻风分枝杆菌比对时的脱氨模式与古DNA一致。此外，人为污染不太可能解释麻风分枝杆菌的检测，也不太可能影响下游的麻风分枝杆菌分析。遗传性别鉴定和单亲系谱分配通过两种比较性染色体与常染色体上序列读取深度的指标来推断生物学性别。遗传性别结果见图S1。线粒体单倍群使用HaploGrep2 v2.4.0确定，而男性个体的Y染色体单倍群使用yHaplo v1.1.2鉴定。线粒体和Y染色体单倍群见表S1。基因分型及与公开数据的合并使用SequenceTools v1.2.2（https://github.com/stschiff/sequenceTools）在包含于1240K和Human Origins（HO）面板中的单SNP位点生成假单倍型基因分型。在1240K面板上覆盖SNP少于20,000个个体的样本被排除在下游人群遗传学分析之外。其余三个个体（G14、G250和G265）的数据与Allen Ancient DNA Resource（AADR）版本62.0的参考数据集进行了合并，适用于两个SNP面板。此外，与研究区域和时期相关但尚未纳入AADR的已发表数据也被纳入参考数据集。基因分型统计见表S1。人群结构与祖源建模使用smartpca v16000进行主成分分析（PCA），采用"lsqproject: YES"选项，将古个体投射到HO参考数据集中现代西欧人群所观察到的变异上。PCA结果见图3和图4。使用qp3Pop v650计算外群f3统计量，使用qpDstat v970计算f4统计量。两项分析均使用1240K数据集，并以Mbuti作为外群。f3统计量和f4统计量见图S2和图S3。为探索祖源成分，使用ADMIXTURE v1.3.0进行无监督聚类，测试K值在3到12之间，并使用200次自举复制进行交叉验证。分析使用了在PLINK v1.90b6.21中生成的连锁不平衡剪枝HO数据集，参数为--indep-pairwise 200 25 0.4。ADMIXTURE结果见图S4。混合模型分析还使用qpAdm v1201完成，参数为"allsnps: YES"。qpAdm分析使用的右侧人群集及其结果列于表S2。个体G265的地理起源推断为对G265的可能地理起源进行建模，使用了mobest v1.0.0，该工具使用高斯过程回归执行遗传祖源的空间时间插值，并估计地理空间中遗传相似性的概率。上述PCA中的前三个主成分被用作祖源坐标。参考数据集包括5,598个通过AADR质量评估（PASS）的古个体，这些个体覆盖1240K SNP超过20,000个，年代在公元前1200年至公元2000年之间，且位于欧洲和地中海地区。AADR元数据中标注为重复、低质量、受污染或近亲的样本被排除，每个Master ID仅保留一个个体。地理坐标转换为EPSG3035，祖源字段在覆盖研究区域的25公里预测网格上进行插值。高斯过程核使用mobest的默认参数设置（空间长度尺度=800公里，时间长度尺度=800年，每个主成分的nugget=0.1）。G265的地理起源通过评估公元500年左右的插值祖源字段来推断，该时间大致对应其考古学年代。地理起源推断结果见图5。病原体筛查使用Megan Alignment Tool（MALT）v0.4.1将处理后的reads与一个经过精心筛选的参考数据库进行比对，该数据库包含从NCBI下载的27,730个细菌和10,543个病毒完整基因组。MALT参数设置为BlastN模式，采用半全局比对和95%的最小百分一致性。随后使用Metagenome Analyzer 6（MEGAN6）v6.25.9检查MALT比对结果。后续使用BWA aln算法（参数如上述）对细菌或病毒参考序列进行比对。使用DeDup v0.12.1去除重复reads，并使用DamageProfiler v1.1创建脱氨图谱。麻风分枝杆菌的脱氨图谱见图S5。使用SAMtools v1.12生成比对统计（麻风分枝杆菌的比对统计数据见表S3）。使用整合基因组浏览器（IGV）v2.17.1手动检查reads比对情况，评估覆盖均匀性和深度以及reads质量和每个read的平均SNP数。最后，使用在线版的Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）v2.15.0分析比对reads，确定期望值（E-value）是否显著（小于1×10??）。麻风分枝杆菌系统发育现代和古代麻风分枝杆菌基因组从NCBI和欧洲核苷酸档案（ENA）数据库下载（表S6）。以FASTA格式下载的基因组使用SAMtools v1.12中的wgsim工具转换为FASTQ，突变率、indel比例、indel延伸概率和碱基错误率均设为零。使用上述相同的BWA aln参数，将所有FASTQ文件与参考基因组麻风分枝杆菌TN菌株（NCBI RefSeq: NC_002677.1）进行比对。生成的BAM文件使用BCFtools v1.12转换为VCF格式，参数如下：读取深度为3，indelgap设为5，修剪2个位置。此外，使用SAMtools v1.12过滤质量低于30的reads，并使用filterSAM v0.0.11应用95%的百分一致性过滤。VCF随后根据3,124个先前被描述为对麻风分枝杆菌系统发育具有信息量的位点进行过滤。使用RAxML v8.2.12生成系统发育树，参数如下：-f a -x 12345 -p 12345 -# 1000 -N 1000 -m GTRGAMMA。注释通过在线的Interactive tree of life（iTOL）v6完成。系统发育树见图6。单核苷酸多态性效应分析为进行SNP效应分析，选择了系统发育树中使用的44个古代株和9个代表性现代株。这53个菌株以及G265菌株的BAM文件按上述麻风分枝杆菌系统发育中的方法转换为VCF格式。但VCF未按3,124个信息位点进行过滤。随后使用SnpEff v5.2f注释这些VCF并对SNP影响进行分类。对SnpEff生成的输出进行解析，仅显示在G265菌株中发现的注释为"HIGH"影响的变异（表S4）。毒力因子分析从毒力因子数据库（VFDB）下载所有麻风分枝杆菌特异性毒力基因（n = 160）。随后使用BWA aln以上述参数将G265产生的reads与这些基因进行比对。使用SAMtools v1.12按比对质量30过滤BAM文件，并使用filterSAM v0.0.11应用95%的百分一致性过滤。使用SAMtools v1.12总结每个基因的比对统计并汇编为表格格式（表S5）。补充信息下载全部PDF（708.72 KB）文件S1. 图S1–S6电子表格（123.03 KB）表S1. 人群遗传学分析摘要电子表格（257.71 KB）表S2. qpAdm建模结果电子表格（98.78 KB）表S3. G265个体产生的reads去除重复后与麻风分枝杆菌TN比对的统计数据电子表格（197.13 KB）表S4. SnpEff分析结果，仅显示高影响变异电子表格（83.03 KB）表S5. 经比对质量30和95%百分一致性过滤后麻风分枝杆菌毒力因子的覆盖情况电子表格（80.82 KB）表S6. 麻风分枝杆菌参考基因组