一年蓬水提物通过调控Th2介导的免疫应答及MAPK信号通路改善OVA诱导的类特应性皮炎皮肤病变

《Pharmaceutical Biology》：Aqueous extract of erigeron annuus ameliorates OVA-induced atopic dermatitis-like skin lesions through modulation of Th2-mediated immune responses and MAPK signaling

　　

背景 特应性皮炎（atopic dermatitis）是一种慢性炎症性皮肤病，特征为表皮屏障功能障碍和失调的2型辅助性T细胞（type 2 helper T cell, Th2）介导的免疫应答。一年蓬（Erigeron annuus (L.) Desf.）传统用于炎症性疾病，但其对特应性皮炎的作用仍不清楚。目的 本研究评估一年蓬水提物（E. annuus aqueous extract, EA）的保护作用及相关机制。材料与方法 在5周龄雌性BALB/c小鼠中通过反复表皮卵清蛋白（ovalbumin, OVA）致敏诱导类特应性皮炎病变，并口服EA六周。评估表皮屏障功能、组织病理学、免疫球蛋白、细胞因子和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路。在脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激的RAW 264.7巨噬细胞中检测pyromeconic acid（PA），其为EA的代表性成分。结果 EA减轻OVA致敏小鼠的类皮炎病变并降低皮炎评分。EA降低经表皮水分流失（transepidermal water loss, TEWL），增加皮肤水合，恢复丝聚蛋白表达，并减少表皮和真皮增厚、肥大细胞浸润、CD4⁺/CD8⁺ T细胞积聚、脾肿大、血清总IgE和OVA特异性IgE以及皮肤白细胞介素-4（interleukin-4, IL-4）和白细胞介素-13（interleukin-13, IL-13）水平。EA还降低背部皮肤中细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）和p38磷酸化以及白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）表达。PA抑制LPS刺激巨噬细胞中MAPK活化和炎症介质表达。讨论与结论 EA改善OVA诱导的类特应性皮炎炎症，与改善表皮屏障功能、减少Th2相关免疫应答和减弱MAPK信号通路相关。PA在体外显示抗炎活性，但其对EA体内效应的贡献尚待确定。EA作为植物来源的候选物，值得进一步研究用于特应性皮炎的补充干预。

特应性皮炎（atopic dermatitis）是一种主要影响婴幼儿和儿童的慢性炎症性皮肤病，以复发性湿疹样病变和剧烈瘙痒为特征。其发病涉及遗传易感性、表皮屏障功能障碍、免疫失调和皮肤微生物群改变。持续瘙痒导致反复搔抓，加重皮肤损伤并降低生活质量，患者还面临其他过敏性疾病风险增加。免疫学上，特应性皮炎以Th2介导的免疫应答占优势，尤其在急性期。IL-4和IL-13等Th2相关细胞因子升高，促进免疫球蛋白E（immunoglobulin E, IgE）类别转换并驱动过敏性炎症。患者和实验模型中常见血清总IgE和过敏原特异性IgE升高，同时丝聚蛋白等表皮屏障蛋白表达受损，促进过敏原穿透并放大免疫激活。当前治疗包括局部糖皮质激素、免疫调节剂以及靶向生物制剂如IL-4受体拮抗剂和IL-13拮抗剂，但长期使用与皮肤萎缩和全身免疫抑制等不良作用相关。因此，仍需开发能同时调节免疫应答和表皮屏障功能障碍的更安全策略。一年蓬为菊科一年生草本植物，原产北美并引入欧洲和亚洲部分地区，含黄酮、酚类化合物和萜类等生物活性成分。东亚传统医学中，其全草用于消化不良、肠炎、流行性肝炎和血尿等，Erigeron属植物也用于炎症和疼痛性疾病。药理研究报道一年蓬提取物具有抗糖尿病、抗肥胖和神经保护等活性。一年蓬水提物及其代表成分pyromeconic acid可抑制TNF-α/IFN-γ诱导的HaCaT角质形成细胞炎症反应，并减轻十二烷基硫酸钠诱导的皮肤屏障破坏。Jeong等（2024）报道口服一年蓬全草热水提取物可减轻1-氯-2,4-二硝基苯（1-chloro-2,4-dinitrobenzene, DNCB）诱导的类特应性皮炎症状，包括表皮增厚、肥大细胞浸润和搔抓行为，并与Nrf2/HO-1抗氧化通路激活相关。Kim等（2021）则主要讨论韩国Erigeron物种作为花粉相关过敏杂草，而非一年蓬提取物的药理作用。既往研究多聚焦细胞皮肤模型、DNCB诱导皮炎或花粉相关过敏暴露，口服一年蓬水提物对过敏原驱动Th2炎症、表皮屏障功能障碍和MAPK信号的影响尚不充分。毒理学信息有限，先前28天重复口服毒性研究显示500或1000 mg/kg/day无显著相关不良作用，但本研究所用特定水提物口服LD50尚未建立；吡咯里西啶生物碱主要与菊科Senecioneae和Eupatorieae有关，而一年蓬属于Astereae，其存在尚未确定，且本研究未专门分析。因此，研究人员评估EA在OVA诱导特应性皮炎小鼠模型中的保护作用，该模型通过反复表皮OVA贴片致敏再现皮肤屏障破坏和搔抓相关损伤，适合评价EA对Th2免疫应答和表皮屏障功能障碍的影响。

关键技术方法概括 研究人员使用OVA诱导BALB/c小鼠类特应性皮炎模型，植物地上部分采集于韩国Muju，2024年6月，经KIOM认证，凭证KIOM202403308，另存HAM-K063-001；制备EA并以HPLC定量PA含量为25.65±0.33 mg/g提取物。动物随机分为对照、OVA对照、EA低剂量200 mg/kg、EA高剂量500 mg/kg和地塞米松（dexamethasone, DEX）1.5 mg/kg组，口服给药六周。评估皮炎评分、TEWL、皮肤水合、苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色、甲苯胺蓝染色、免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）检测丝聚蛋白和CD4⁺/CD8⁺、血清免疫球蛋白和皮肤细胞因子ELISA、脾qRT-PCR及背部皮肤Western blot。体外使用LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞，PA处理，采用CCK-8、Griess试剂和Western blot分析MAPK及炎症介质。BALB/c小鼠来自Koatech，RAW 264.7来自ATCC。

研究结果
EA对OVA致敏小鼠特应性皮炎相关和生理参数的影响：OVA对照小鼠出现明显类特应性皮炎症状，皮炎评分显著升高，EA低剂量和高剂量分别降至OVA对照的0.61倍和0.39倍。OVA对照TEWL显著升高，EA抑制该升高；皮肤水合在OVA致敏后显著下降，EA剂量依赖恢复。最终体重和血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）无显著组间差异；血清天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）在OVA对照升高，EA或DEX未进一步升高；无死亡或异常临床体征。

EA对OVA致敏小鼠血清免疫球蛋白水平的影响：OVA致敏使总IgE显著升高15.47倍，EA低剂量和高剂量分别降至OVA对照的0.66倍和0.55倍，达到与DEX相当水平。OVA特异性IgE在OVA对照显著升高，EA显著抑制其产生。血清IgG在OVA对照升高5.59倍，高剂量EA降至0.69倍，提示EA减弱OVA诱导体液免疫激活。

EA对OVA致敏小鼠脾形态和细胞因子表达的影响：OVA对照脾明显增大，脾重量和长度显著增加。EA减轻脾肿大，脾长度在EA低剂量和高剂量组显著降低，脾重量仅DEX组显著降低。OVA致敏显著增加脾IL-4和IL-6 mRNA表达，EA剂量依赖抑制IL-4 mRNA，高剂量EA显著降低IL-6 mRNA。

EA对OVA致敏小鼠背部皮肤组织病理学改变的影响：H&E染色显示OVA对照表皮增生和真皮增厚，EA低剂量和高剂量均显著降低表皮和真皮厚度。甲苯胺蓝染色显示OVA对照真皮肥大细胞浸润显著增加，EA显著减少肥大细胞浸润。IHC显示OVA致敏降低丝聚蛋白阳性面积，EA显著恢复丝聚蛋白表达，达到与DEX相当水平。

EA对OVA致敏小鼠背部皮肤T细胞浸润和Th2细胞因子产生的影响：IHC显示OVA对照CD4⁺和CD8⁺ T细胞浸润显著增加，EA低剂量和高剂量均显著降低其阳性面积。ELISA显示OVA对照皮肤IL-4和IL-13显著升高，EA显著降低IL-4和IL-13水平，表明EA抑制皮肤Th2极化细胞因子应答。

EA对OVA致敏小鼠背部皮肤MAPK信号相关蛋白水平的影响：Western blot显示OVA对照p-ERK/ERK和p-p38/p38比值显著升高，EA低剂量和高剂量均显著降低。OVA对照IL-1β蛋白显著升高，EA显著降低其表达。结果提示EA至少部分通过抑制MAPK信号和减少促炎IL-1β减轻OVA诱导皮肤炎症。

PA对LPS刺激RAW 264.7细胞中MAPK信号和炎症介质蛋白水平的影响：PA在28.2 μg/mL及以下未显著降低细胞活力，35.25 μg/mL时细胞活力显著下降，因此后续使用14.1–28.2 μg/mL。PA预处理不显著影响LPS刺激后细胞活力，并显著减少LPS诱导一氧化氮（nitric oxide, NO）产生。LPS刺激显著增加p-ERK/ERK、p-JNK/JNK和p-p38/p38比值，PA浓度依赖抑制MAPK活化。LPS增加环氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）蛋白表达，PA显著降低这些炎症介质。提示PA在测试体外条件下通过抑制LPS诱导MAPK活化和炎症介质表达发挥抗炎活性。

讨论部分总结 特应性皮炎是多因素炎症性皮肤病，以表皮屏障功能障碍和免疫失调为特征，患病率在工业化地区持续增加，湿疹样病变、严重瘙痒和干燥显著损害生活质量。尽管治疗策略向屏障特征、免疫表型和遗传背景的个体化方向发展，但长期有效选择仍有限，需要更安全有效的天然产物来源方法。研究人员采用OVA诱导表皮致敏模型模拟类特应性皮炎表皮屏障破坏和炎症反应。EA口服显著减轻OVA诱导的病理特征。表皮屏障方面，丝聚蛋白是角质层主要结构蛋白，维持表皮水合、pH调节、抗菌防御和天然保湿因子生成，其功能丧失突变与特应性皮炎及特应性进程相关。EA恢复丝聚蛋白表达，降低TEWL并增加皮肤水合。Th2细胞因子IL-4和IL-13是过敏性炎症中心介质，驱动B细胞类别转换、免疫球蛋白产生、嗜酸性粒细胞扩增和肥大细胞脱颗粒。EA减弱Th2极化免疫应答，降低血清IgE和IgG。MAPK信号通路，尤其ERK、JNK和p38，通过调节炎症应答、免疫细胞活化和表皮屏障功能参与特应性皮炎。EA显著抑制背部皮肤ERK和p38磷酸化。与Jeong等（2024）报道的冻干热水提取物在DNCB模型中的作用及Nrf2/HO-1信号不同，本研究使用认证地上部分水提物并定量PA，采用OVA表皮致敏模型，聚焦表皮屏障、Th2相关免疫应答和MAPK信号。PA是E. annuus天然成分，曾与其葡萄糖苷衍生物erigeroside和3′-O-caffeylerigeroside从地上部分分离。Kang等（2024）报道PA富集水提物和PA在肥大细胞和角质形成细胞中具有抗炎、抗氧化、抗组胺和皮肤屏障保护活性，包括减少促炎细胞因子和氧化应激、减少组胺释放、减轻十二烷基硫酸钠诱导屏障功能障碍并增加丝聚蛋白mRNA。本研究中PA抑制LPS刺激RAW 264.7细胞MAPK活化和炎症介质表达，支持其体外抗炎活性。但该模型主要反映巨噬细胞介导的固有炎症应答，不重现Th2介导炎症或表皮屏障功能障碍，不能直接机制验证PA在特应性皮炎中的作用；且LPS刺激RAW 264.7实验未设药理学阳性对照，无法直接比较PA与已知参比化合物的效果。PA约占EA的2.57%，对应EA 200和500 mg/kg剂量下估计口服PA摄入约5.13和12.83 mg/kg。体外PA浓度14.1–28.2 μg/mL对应约0.55–1.10 mg/mL EA。纯PA未在OVA诱导特应性皮炎小鼠模型中评估，其药代动力学包括口服生物利用度和皮肤分布尚未表征，PA对EA效应的具体贡献仍不确定。安全性方面，EA不影响最终体重或血清ALT，实验期间无死亡或异常临床体征；OVA对照AST升高，EA未进一步增加。先前28天重复口服毒性研究显示500或1000 mg/kg/day无显著治疗相关不良作用，本研究剂量等于或低于该研究。局限包括：本研究EA制剂与Jeong等（2024）不同，口服LD50未建立，血液学、肾功能、心血管和其他器官安全性指标未评估；EA为粗水提物，含多成分，额外HPLC峰未结构鉴定或定量，其他成分贡献不能排除，需LC-MS/MS进一步鉴定；单一OVA模型不能完全再现人类特应性皮炎慢性和复发性特征，需慢性和复发性模型及临床研究。结论翻译：EA改善OVA诱导小鼠类特应性皮炎皮肤病变，与改善表皮屏障功能和减弱Th2主导免疫应答相关。这些保护作用与MAPK信号减弱和皮肤促炎介质下调相关。此外，pyromeconic acid作为EA代表性成分，在巨噬细胞中抑制MAPK活化和炎症反应，支持其在测试体外条件下的抗炎活性，尽管其对EA体内效应的具体贡献尚待确定。综上，这些结果表明EA对类特应性皮炎皮肤炎症的保护作用与表皮屏障完整性、Th2相关免疫应答和MAPK信号的协同调节相关。EA因此可能代表一种植物来源候选物，值得进一步研究作为特应性皮炎的补充干预，但仍需进一步研究以表征其活性成分、药代动力学特性、毒理学特征和临床疗效。