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糖蛋白Ibα（GPIbα）是一种血小板特异性受体，可被ADAM17蛋白酶水解切割，释放其胞外域片段glycocalicin。GPIbα的蛋白水解由强烈的血小板活化诱导，但其速度过慢，不足以在初级止血中发挥关键作用。研究人员利用人源和小鼠样本，结合体外实验与下腔
糖蛋白Ibα（GPIbα）是一种血小板特异性受体，可被ADAM17蛋白酶水解切割，释放其胞外域片段glycocalicin。GPIbα的蛋白水解由强烈的血小板活化诱导，但其速度过慢，不足以在初级止血中发挥关键作用。研究人员利用人源和小鼠样本，结合体外实验与下腔静脉（IVC）结扎模型，评估了血栓形成过程中glycocalicin的时空命运。研究发现，人血栓内部glycocalicin浓度比初始血浆高4倍（分别为4.0±0.8 μg/mL与0.9±0.0 μg/mL）。这一现象在人富血小板血浆和小鼠全血的体外实验中均得到证实，分别观察到6倍和3倍的升高。在体内IVC结扎模型中，glycocalicin在血栓内的滞留更为显著，血栓内浓度达到135.1±44.3 μg/mL，而血浆中仅为8.2±1.0 μg/mL。在使用ADAM17抑制剂的情况下，人血栓内glycocalicin浓度较ADAM17功能正常组降低了3倍。然而，在药理学抑制或基因敲除ADAM17的小鼠中，ADAM17的抑制对血栓内GPIbα脱落无限制作用。总之，GPIbα脱落发生在血栓内部，并导致glycocalicin的最大程度滞留。血栓内GPIbα脱落在不同物种间保守，但其调控机制存在差异。
研究背景、现存问题与研究目的
血小板表面的糖蛋白Ibα（GPIbα）是血小板特异性受体，其胞外域可被金属蛋白酶ADAM17切割，释放出可溶性片段glycocalicin。尽管GPIbα脱落被认为是血小板活化的标志之一，但由于其动力学相对缓慢，其在止血过程中的即时作用并不明确。长期以来，glycocalicin主要被视为血小板衰老或储存损伤的标志物，而其是否在血栓形成过程中具有生物学功能尚不清楚。一个核心问题是：glycocalicin从血小板表面脱落后，是被释放到血液循环中，还是滞留在血栓微环境内部？此外，人和小鼠在调控GPIbα脱落的分子机制上是否存在差异，也缺乏系统性比较。为此，研究人员整合了体外血栓模型和人源样本分析，并结合小鼠下腔静脉（IVC）结扎的体内血栓模型，旨在阐明glycocalicin在血栓形成过程中的时空分布规律，并评估ADAM17在不同物种中对这一过程的调控作用。
主要技术方法
- 1.
体外血栓形成模型：采用人全血或富血小板血浆（PRP），以及小鼠全血，通过添加CaCl2（15 mM）在37℃振荡孵育2小时诱导血栓形成，收集血清和血栓匀浆用于后续检测。
- 2.
体内血栓模型：采用小鼠下腔静脉（IVC）狭窄结扎模型，在结扎后4小时采集血栓和血浆样本。
- 3.
酶联免疫吸附试验（ELISA）定量检测：分别建立人和小鼠glycocalicin的特异性夹心ELISA方法，用于定量检测血浆、血清及血栓匀浆中的glycocalicin浓度。
- 4.
ADAM17功能干预：使用ADAM10/ADAM17双重抑制剂GW280264X和选择性ADAM17抑制剂KP-457进行药理学抑制；同时利用血小板特异性ADAM17条件性基因敲除小鼠（ADAM17-/-，即Adam17lox/lox PF4-Cre）进行遗传学验证。
- 5.
校正因子：通过检测抗SARS-CoV-2 RBD IgG（人）或总IgG（小鼠）在血清和血栓匀浆中的比例，对血栓内蛋白的稀释和不完全释放进行校正。
研究结果
Glycocalicin在血栓形成后被滞留于血栓内部
人全血血栓匀浆中glycocalicin浓度为4.0±0.8 μg/mL，显著高于周围血清中的1.0±0.1 μg/mL。基于PRP的血小板血栓中，glycocalicin浓度更高，达8.3±1.2 μg/mL，对应血清为1.4±0.2 μg/mL。在小鼠体外血栓中，血栓内glycocalicin浓度为12.8±1.3 μg/mL，血清为5.5±0.7 μg/mL。在小鼠体内IVC结扎模型中，血栓内浓度高达135.1±44.3 μg/mL，而循环血浆中仅为8.2±1.0 μg/mL。与初始血浆相比，人全血和PRP血栓中glycocalicin的富集倍数分别为约4.4倍和5.9倍，小鼠体外约为3.5倍，而体内IVC模型则高达约11.6倍。
循环中glycocalicin水平的决定因素：ADAM17与血小板数量的贡献
对408例健康献血者的血浆分析显示，glycocalicin中位浓度为846 ng/mL，与年龄和血小板计数呈弱相关，但与性别无关。在ADAM17-/-小鼠中，血浆glycocalicin水平（1.3±0.5 μg/mL）显著低于同窝对照（7.1±2.6 μg/mL），而两组血小板数量无显著差异，表明稳态下的glycocalicin释放依赖于ADAM17活性。
GPIbα脱落对ADAM17的依赖性存在种属差异
在人全血和PRP血栓中，加入ADAM17抑制剂后，血栓内glycocalicin浓度显著降低约3倍（从1.6±0.5降至0.8±0.1 μg/mL），血清中也相应降低。然而，在小鼠体外实验中，无论使用ADAM17抑制剂还是在ADAM17-/-小鼠的全血中，血栓内glycocalicin浓度与对照组相比均无显著差异。在体内IVC结扎模型中，ADAM17-/-小鼠血栓内glycocalicin浓度为153.8±51.7 μg/mL，与对照组的135.1±44.3 μg/mL也无统计学差异。进一步计算显示，ADAM17-/-小鼠血栓相对于血浆的富集倍数超过100倍，远高于对照组的约20倍，这进一步凸显了种属间的调控差异。
讨论与结论
本研究证实，glycocalicin在血栓形成过程中被大量产生并有效滞留在血栓内部，其浓度远超循环水平。这种滞留现象可能与血栓内部结构的异质性有关：在致密的血小板核心区域，由于孔径限制，分子量较大的glycocalicin（水动力学半径约7.8 nm）难以扩散出去，从而被局限在血栓微环境中。人源实验中，ADAM17抑制剂可显著降低血栓内glycocalicin水平，证明人类血栓中GPIbα脱落主要依赖ADAM17。然而，在小鼠中，无论是药理学抑制还是基因敲除ADAM17，均未能减少血栓内glycocalicin的产生，表明小鼠在血栓形成过程中存在ADAM17非依赖性的GPIbα脱落途径，可能存在其他金属蛋白酶如ADAM10、MMP2/9或calpain的代偿作用。这一发现首次揭示了GPIbα脱落调控在稳态与血栓形成条件下的差异，以及不同物种之间的重要区别。
研究结论：GPIbα脱落发生在血栓形成过程中，并导致glycocalicin在血栓内部的高度滞留。这种血栓内GPIbα脱落现象在人与小鼠之间是保守的，但其调控机制存在显著的种属依赖性差异。
