《Genes》：Comparative Transcriptomic Profiling of Diabetic Wound Responses to Recombinant Periplaneta americana Thymosin Isoforms in Male ob/ob Mice
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背景： 源自美洲大蠊（Periplaneta americana）的制剂，如康复新液，已在中国用于伤口和溃疡管理，但其活性成分尚未完全明确。已有报道称重组美洲大蠊胸腺肽亚型（Pa-THYs）可加速非糖尿病小鼠的伤口闭合。这些亚型在糖尿病伤口中的效应及相关转录反
背景： 源自美洲大蠊（Periplaneta americana）的制剂，如康复新液，已在中国用于伤口和溃疡管理，但其活性成分尚未完全明确。已有报道称重组美洲大蠊胸腺肽亚型（Pa-THYs）可加速非糖尿病小鼠的伤口闭合。这些亚型在糖尿病伤口中的效应及相关转录反应尚不清楚。方法： 将三种Pa-THYs（THY1–3）局部应用于ob/ob糖尿病小鼠的全层切除伤口，以胸腺肽β4（Tβ4）和磷酸盐缓冲液（PBS）分别作为阳性和阴性对照。通过平面测量法、苏木精和伊红（H&E）染色、马森三色染色和CD31免疫组织化学评估伤口愈合情况。在伤后第3天和第8天对伤口组织进行RNA测序，随后进行差异基因表达分析、基因本体论（GO）和通路富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用网络构建、基于标记基因的细胞类型相关表达评分以及预排序基因集富集分析（GSEA）。结果： 在第8天，THY1、THY2、THY3和Tβ4组的平均伤口闭合百分比范围为95%至97%，而PBS组为81%。在该时间点，治疗组伤口显示出更完整的上皮覆盖。所有活性治疗组的CD31阳性面积分数均较高，而THY2和THY3组的胶原体积分数高于PBS组。在Pa-THY组中，THY2在第3天显示出最大的差异表达基因（DEG）集合，而THY1和THY3在后期时间点显示出显著的上皮分化特征。THY3在第8天显示出最大的DEG集合以及与Tβ4最大的成对DEG重叠。作为一种互补的阈值独立分析方法，GSEA在THY1、THY3和Tβ4中识别出协调的早期代谢反应、广泛分布的干扰素相关富集以及晚期角化富集。结论： 局部应用THY1、THY2和THY3改善了雄性ob/ob小鼠在第8天的伤口闭合，并伴有上皮覆盖、CD31阳性面积分数和胶原染色的变化。转录组学结果表明存在共享的通路水平反应以及时间和亚型相关的差异。这些结果支持对Pa-THYs进行进一步的临床前评估。
论文解读文章
研究背景与目的
糖尿病是慢性难愈性伤口的主要风险因素，约20-30%的糖尿病患者在其一生中会发展出慢性皮肤溃疡，如糖尿病足溃疡。正常的伤口愈合需要血管生成、免疫调节和再上皮化等过程的协同作用，但这些过程在糖尿病伤口中均受到损害。目前针对慢性糖尿病伤口的治疗方法包括伤口敷料、小分子药物和皮肤移植等，但能够显著改善愈合结局的药物仍然有限。源自美洲大蠊的制剂，如康复新液，已在中国用于伤口和溃疡管理，但其活性成分尚未完全明确。美洲大蠊胸腺肽亚型在结构上与哺乳动物的胸腺肽β4同源，前期研究显示三种重组Pa-THY亚型在非糖尿病小鼠中可加速全层皮肤伤口闭合。然而，这些亚型在糖尿病伤口中是否仍保持修复活性及其相关的转录反应差异尚不清楚。本研究旨在比较THY1、THY2和THY3在雄性ob/ob糖尿病小鼠中的伤口修复效果和治疗相关的转录反应，以PBS和Tβ4作为对照。
主要技术方法
研究人员建立了雄性ob/ob糖尿病小鼠的全层切除伤口模型，共75只小鼠随机分为五组，每组15只。局部每日一次给予25μg/cm2的THY1、THY2、THY3或Tβ4，PBS作为阴性对照。采用平面测量法计算伤口闭合率，通过H&E染色、马森三色染色和CD31免疫组织化学进行组织学评估。在第3天和第8天采集伤口组织进行RNA测序，测序数据提交至CNGBdb数据库。数据分析包括主成分分析和层次聚类、DESeq2差异基因表达分析、g:Profiler进行GO和KEGG富集分析、clusterProfiler进行预排序GSEA、STRING数据库和Cytoscape构建PPI网络，以及基于定制标记基因集的细胞类型相关表达评分。
研究结果
3.1 宏观和组织学伤口愈合评估
通过伤口照片和平面测量发现，Pa-THYs和Tβ4处理的伤口较PBS组更小且结痂更早。在第8天，四个治疗组的平均伤口闭合率达95-97%，而PBS组仅为81%。组织学评估显示，治疗组在第8天上皮覆盖更完整。CD31阳性面积分数在第5天时THY2、THY3和Tβ4组显著高于PBS，第8天时所有治疗组均显著高于PBS。马森三色染色显示，THY2和THY3组在第8天的胶原体积分数显著高于PBS，其中THY2组均值最高。
3.2 主成分分析和Spearman相关性距离聚类
PCA结果显示，PC1解释了60.1-67.2%的方差，PC2解释了5.5-7.7%。Tβ4处理样品沿PC1与PBS对照组明显分离，Pa-THY处理样品位于Tβ4和PBS组之间。样品还按时间点分离，第3天和第8天形成不同的簇。无监督层次聚类证实了PCA结果，样品主要按处理条件聚类，PBS对照组在两个时间点保持稳定的表达模式。
3.3 差异表达基因分析
差异基因数量在不同处理组和时间点之间存在差异。THY1和THY3在第3天分别仅有3个和7个DEGs，到第8天增加到51个和467个。Tβ4呈现相似趋势（第3天110个，第8天369个）。相比之下，THY2在第3天有110个DEGs，第8天减少到76个。维恩图显示，第3天大多数DEGs仅在一个处理对比中出现，而第8天组间重叠显著增加。THY3贡献了最大的独特DEGs集合（206个，34%），并与Tβ4共享158个DEGs（26%）。细胞类型相关标记表达评分显示，第3天THY1组多个髓系相关标记得分较高，而THY3和Tβ4组中性粒细胞相关得分较低。第8天，多个处理组的淋巴样相关标记得分高于PBS。
3.4 GO和KEGG功能富集分析
第3天，处理组上调基因主要富集于细胞增殖和免疫反应通路，特别是THY2组显著富集先天免疫反应和细胞因子通路。下调基因富集于神经系统发育相关条目。第8天，THY3和Tβ4上调基因富集于表皮和皮肤发育通路，包括角化、角质形成细胞分化和表皮发育。THY1和THY3上调基因富集于中间丝细胞骨架组织。THY2未显示表皮发育条目富集，其上调基因富集于免疫反应和干扰素相关基因集。KEGG分析证实了GO发现，第8天上调基因富集于感染注释和先天免疫信号通路，THY3下调基因富集于肌肉相关通路。
3.5 预排序基因集富集分析
GSEA在所有八个对比中识别出协调的通路水平表达模式。氧化磷酸化在所有四个第3天对比中正向富集，而在所有四个第8天对比中负向富集。脂肪酸代谢和三羧酸循环也呈现类似的第3天正向和第8天负向富集。角化在第8天的THY1、THY3和Tβ4对比中正向富集。干扰素-α反应基因集在所有八个对比中正向富集，干扰素-γ反应在所有四个第8天对比中显著富集。细胞外基质组织在第3天和第8天的大多数对比中负向富集。
3.6 PPI网络分析
THY1和THY3第8天网络中，许多高度连接基因编码角蛋白相关蛋白和角蛋白。THY3第8天网络包含一个干扰素相关基因群，包括上调的Oas1a、Oas1b、Oas1g、Oas2、Mx2、Ddx60、Zbp1、Usp18、Ifi44等。THY2第3天网络包括与炎症和先天免疫反应相关的基因以及脂质代谢相关基因。THY2第8天网络的高度连接基因主要与干扰素反应相关。
讨论与结论
本研究表明，局部Pa-THY处理改善了ob/ob糖尿病小鼠在第8天的伤口闭合，伴随CD31阳性面积分数增加，THY2和THY3组的胶原体积分数更高。Pa-THY组与Tβ4组在第8天伤口闭合方面未检测到显著差异。这些观察将Pa-THYs在非糖尿病伤口模型中的疗效扩展到了糖尿病背景。转录组分析揭示了涉及上皮分化、免疫信号传导和代谢的共享及亚型相关表达模式。在上皮分化方面，THY1和THY3在第8天表现出角蛋白和角蛋白相关蛋白基因的表达增加，以及GSEA中角化的正向富集。在免疫相关反应方面，干扰素相关表达在多个处理组中广泛共享，同时THY3在第8天还表现出淋巴细胞相关基因表达增加。在代谢反应方面，THY2早期的脂质合成相关基因表达改变，以及所有处理组在第3天正向富集、第8天负向富集的氧化磷酸化和脂肪酸代谢模式，表明不同采样时间点的代谢转录反应存在差异。
研究结论
局部应用THY1、THY2或THY3改善了雄性ob/ob小鼠在第8天的伤口闭合，并伴有更高的CD31阳性面积分数。THY2和THY3组还显示出更高的胶原体积分数，表明修复过程中局部胶原积累更多。Pa-THY组与Tβ4组在第8天伤口闭合方面未检测到统计学显著差异。转录组分析揭示了涉及上皮分化、免疫信号传导和代谢的共享及亚型相关反应。GSEA识别出第3天代谢基因集的正向富集和第8天的负向富集，以及在THY1、THY3和Tβ4组中共享的干扰素相关富集和第8天角化富集。总之，这些发现证明了伤口闭合的改善伴随着组织和转录水平的变化，并支持对重组美洲大蠊胸腺肽亚型用于糖尿病伤口修复进行进一步的临床前评估。
