表观遗传年龄加速（EAA）增强早期非小细胞肺癌（NSCLC）总生存预测：GrimAge2时钟优于传统风险因素

《iScience》：Epigenetic age acceleration enhances prediction of overall survival in early-stage non-small cell lung cancer

　　

表观遗传年龄受吸烟等环境因素影响，可预测一般人群死亡率，但在早期肺癌中仍未得到充分探索。研究人员分析了75名早期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的Boston Lung Cancer Study参与者的血液DNA甲基化，其中63人在随访期间死亡。使用Horvath、Hannum、PhenoAge和GrimAge2时钟估计表观遗传年龄加速（epigenetic age acceleration, EAA），并通过Cox模型和随机生存森林（random survival forests, RSFs）进行评估。在所有时钟中，EAA显著预测早期NSCLC的生存。GrimAge2 EAA获得最高预测准确性（C index=0.73±0.04），并在RSF模型中成为生存的主导预测因子（变量重要性=5.7%），超过吸烟和年龄。GrimAge2 EAA与死亡率呈非线性关联，其中当前吸烟者在等效EAA下比曾吸烟者或从不吸烟者具有>10%更高的预测死亡风险，该模式在Kaplan-Meier分析中得到确认。GrimAge2 EAA是一种有前景的生物标志物，可结合传统临床因素实现风险分层的个性化。

论文解读：表观遗传年龄加速增强早期非小细胞肺癌总生存预测

研究背景与问题：肺癌，尤其非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），仍是美国癌症相关死亡首位，约占所有癌症死亡的20%。2025年预计新诊断226,650例，死亡124,730例。尽管早期检测和靶向治疗改善生存，NSCLC结局仍高度可变。美国近三分之一NSCLC诊断时为早期，但早期NSCLC生存率显著低于其他常见癌症；局限性NSCLC 5年相对生存率约68%，而局限性乳腺癌和前列腺癌均超过99%。因此，需要识别能捕捉NSCLC结局异质性的生物标志物，改善预后预测和临床决策。表观遗传年龄通过DNA甲基化（DNA methylation, DNAm）估计，是生物衰老和疾病易感性的有前景标志物。与实足年龄不同，表观遗传年龄反映遗传、环境和生活方式影响的累积分子变化。第一代时钟如Horvath和Hannum主要预测实足年龄；后续PhenoAge和GrimAge纳入基于甲基化的临床生物标志物替代物，如C反应蛋白和血糖，以捕捉衰老相关生物信号。偏离实足年龄称表观遗传年龄加速（epigenetic age acceleration, EAA），与癌症发生、心血管疾病和全因死亡相关。在肺癌中，EAA可能提供独特预后见解，因其捕捉环境暴露和生物因素。吸烟是主要风险因素，但空气污染、职业致癌物和二手烟也重要，尤其对从不吸烟者。EAA可能比吸烟史或实足年龄更全面。尽管表观遗传时钟已用于预测肺癌发生，其在肺癌死亡预测中的作用仍未充分探索。本研究旨在75例早期NSCLC患者中调查EAA是否预测总生存（overall survival, OS），是否提供超越既定风险因素的预后价值，并检查EAA与死亡率关联是否因吸烟状态而异。

研究设计与结论意义：研究人员分析了Boston Lung Cancer Study（BLCS）1998—2008年诊断的75例早期NSCLC患者血液DNAm数据，随访中63例死亡。使用Horvath、Hannum、PhenoAge和GrimAge2时钟估计EAA，采用Cox比例风险模型和随机生存森林（random survival forests, RSFs）评估。结果显示，EAA显著预测早期NSCLC生存，GrimAge2 EAA预测准确性最高（C index=0.73±0.04），在RSF中为生存主导预测因子（变量重要性=5.7%），超过吸烟和年龄。GrimAge2 EAA与死亡率呈非线性关联，当前吸烟者在等效EAA下预测死亡风险比曾吸烟者或从不吸烟者高>10%。研究意义在于，GrimAge2 EAA可作为有前景生物标志物，与传统临床因素一起用于个性化风险分层。

关键技术方法概述：研究人员基于Boston Lung Cancer Study（BLCS）1998—2008年诊断的早期NSCLC患者，采用极端表型抽样，最终纳入75例有血液DNAm数据者；血液样本用Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip（850K）检测。使用Clock Foundation计算Horvath、Hannum、PhenoAge和GrimAge2，EAA定义为表观遗传年龄对实足年龄回归的残差。采用逆选择概率加权（inverse probability of selection weighting, IPSW）校正抽样，构建Cox比例风险模型和RSF（1000棵树，重复500次），计算时间依赖AUC、袋外误差、Breiman-Cutler变量重要性（Breiman-Cutler variable importance, BCVI）、部分依赖图和IPSW加权Kaplan-Meier曲线；主要调整年龄、性别和吸烟状态，并以包-年、分期、组织学及辅助治疗作敏感性分析。

研究结果：研究人群和基线特征。75例早期NSCLC患者平均实足年龄69.4岁（SD=8.2），曾吸烟者46例（61.3%），当前吸烟者24例（32.0%）。肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）29例（38.7%），鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma, LUSC）18例（24%），细支气管肺泡癌（bronchioalveolar carcinoma, BAC）15例（20%），其他13例（17.3%）。临床分期IA 38例（50.7%），IB 36例（48.0%），I期1例。随访中63例死亡（84.0%），10例复发（13.3%）。与长生存者（n=36）相比，短生存者（n=39）更可能为当前吸烟者和IB期，较少LUAD或BAC组织学，包-年更高，略年长，更多男性。所有时钟中短生存者平均EAA为正，长生存者为负，GrimAge2差异最大（短生存者+3.4年，SD=6.9；长生存者?3.7年，SD=5.9）。

表观遗传年龄加速跨时钟预测总生存。Cox比例风险模型加IPSW并调整年龄、性别、吸烟状态。所有时钟EAA与死亡率显著关联。Hannum EAA风险比最强（HR=1.09，95% CI：1.05–1.13，p=3.64×10^-6），GrimAge2 EAA预测判别略高（C index=0.73，Hannum为0.72）。Horvath EAA关联最弱（HR=1.05，95% CI：1.01–1.11，p=0.029），C index较基础模型下降ΔC=?0.005。除Horvath外，EAA模型预测判别优于包-年模型；GrimAge2较基础模型C index提高+0.042，包-年单独为+0.008。吸烟状态在所有Cox模型中显著，但交互模型Rao-Scott似然比检验不显著（p>0.1），表明死亡率与EAA关联不因吸烟组显著不同。时间依赖AUC至诊断后20年显示，2.9至7.6年存在死亡率数据缺口，但短、长生存者模式一致；除Horvath外，EAA模型在14年内优于基础和包-年模型，GrimAge2最高（0—14年AUC范围0.73—0.86），随后Hannum和PhenoAge；14年后因风险人数减少（n=24）判别指标趋同。

随机生存森林确认GrimAge2为重要死亡预测因子。RSF加IPSW，重复500次。GrimAge2 EAA袋外预测误差最低（33.6%，SD=0.4），基础模型为38.4%（SD=0.4）。时间依赖AUC确认GrimAge2在14年内预测判别增强。BCVI显示，基础模型吸烟状态最重要（7.4%，SD=0.3），年龄次之（1.8%）。Horvath、Hannum和PhenoAge模型中吸烟仍主导（BCVI分别为6.2%、5.8%、5.8%），在500次迭代中100%为最重要预测因子；这些模型中EAA重要性分别为1.4%、1.7%、2.6%。GrimAge2模型中，GrimAge2 EAA最重要（BCVI=5.7%，SD=0.4），在97.6%迭代中居首，超过吸烟（4.7%）和年龄（1.2%）。

调整包-年和临床因素后EAA关联仍稳健。EAA与包-年联合调整后，GrimAge2 EAA与包-年相关性最高（Pearson r=0.31，R²=0.096），HR从1.07变为1.06（变化?1.2%），仍显著（p=0.023）。其他时钟变化小：PhenoAge ?0.8%，Hannum ?1.0%，Horvath +0.1%。所有包-年调整EAA模型判别优于单独包-年；GrimAge2改善最大，Cox模型ΔC-index=+0.028，RSF模型ΔError rate=?3.8%。GrimAge2 EAA在包-年调整后仍为最重要预测因子（BCVI=4.7%）。进一步调整临床分期和组织学亚型，HRs仅轻微衰减；辅助治疗调整结果类似。GrimAge2 HR变化+0.1%（HR=1.07，95% CI：1.02–1.13，p=0.007）。EAA也改善超过单独临床协变量。分期和组织学调整的Hannum、PhenoAge、GrimAge2在Cox模型中判别相似（C index=0.74）；RSF中误差降低相似，但GrimAge2降低最大且为唯一排名最重要的EAA指标（BCVI=4.3%）。

GrimAge2 EAA的死亡风险梯度因吸烟状态而异。基于GrimAge2 EAA RSF模型的部分依赖图显示非线性关系。正EAA（加速衰老）时，预测死亡风险从0年的39%约线性增至+5年的50%，>5年平台，>11年略增至55%。负EAA（减速衰老）时，0至?4年风险稳定在39%，?6年降至34%，更大减速平台在33%。按吸烟状态分层后，GrimAge2 EAA与死亡风险关系形状一致，与Cox模型无统计交互一致；但绝对风险不同。曾吸烟者与从不吸烟者在等效EAA下预测风险相似，例如GrimAge2 EAA
GrimAge2加速定义不同生存模式。IPSW标准化Kaplan-Meier曲线按GrimAge2 EAA正（Accelerated）和负（Decelerated）分组。加权log rank检验显示GrimAge2 EAA组间差异显著（p=0.0008），而Horvath（p=0.83）、Hannum（p=0.30）、PhenoAge（p=0.13）无显著差异。基于部分依赖图平台定义高加速（GrimAge2 EAA>+5年）和高减速（-4）。中度加速和减速也有差异但较小，尤其前10年。按吸烟状态分为加速前吸烟、减速前吸烟、加速当前吸烟、减速当前吸烟四组，排除从不吸烟者。减速前吸烟者生存概率最高，加速当前吸烟者最低，3年生存概率仅16%，15年后无生存者。加速前吸烟者与减速当前吸烟者生存概率相似，但减速当前吸烟者仅5例，解释需谨慎。加权生存曲线在当前与曾吸烟者中，加速个体（p=0.008，n=39）和减速个体（p=0.020，n=31）均显著不同。

讨论部分总结：研究结果表明，应用EAA改善早期NSCLC总生存模型预测，GrimAge2在Cox和RSF中最有力。Hannum EAA在Cox中HR最强，但GrimAge2在RSF中最重要，并在诊断后14年内显示更优预测判别。GrimAge2设计可解释其优越性：作为第二代时钟，其使用DNAm替代临床生物标志物（如C反应蛋白、A1C、瘦素）及包-年替代。敏感性分析显示自报包-年仅解释GrimAge2 EAA 9.6%方差，调整包-年后关联仅轻微衰减且GrimAge2仍超越包-年；这与Lu et al.发现DNAm替代优于自报包-年一致。GrimAge还含TIMP-1替代物，TIMP-1由肺肿瘤分泌并与肺癌不良预后、慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）和肺纤维化相关。研究提示EAA对死亡风险影响按吸烟状态分层：当前吸烟者在相当GrimAge2 EAA下死亡风险高于曾或从不吸烟者。当前吸烟者平均GrimAge2 EAA最高，但高/中加速组当前和曾吸烟者数量相当，死亡差异不大可能仅由EAA差异驱动。RSF中吸烟状态始终排名第二，与GrimAge2 EAA重要性相当。既往研究显示诊断后继续吸烟与更快进展、较差治疗反应和总死亡增加相关；吸烟的系统效应包括免疫失调和慢性炎症，可能通过GrimAge2捕获通路交互。与克隆性造血不确定潜能（clonal hematopoiesis of indeterminate potential, CHIP）类比，Nachun et al. 2021发现CHIP且Hannum和GrimAge EAA阳性者死亡率高于单独CHIP或EAA阳性，说明共享生物通路的衰老预测因子仍捕获不同风险维度。非线性关系显示风险在EAA>+5年和
研究结论翻译：总之，研究人员的发现支持基于血液的GrimAge2作为一种易于获取且临床相关的生物标志物的潜在效用，其可改善早期NSCLC的生存预测并超越传统风险因素。尽管需要在更大规模的当代队列中进行验证，这些结果凸显了表观遗传衰老指标在个体化癌症预后中的潜力。