肠道微生物依赖的植物固醇硫酸酯在小鼠体内的生成与组织分布

《iScience》：Microbiome-dependent phytosterol sulfates production and tissue distribution in mice

　　

膳食脂质的微生物生物转化（如胆固醇）影响宿主稳态。尽管对动物固醇在宿主-微生物群相互作用中的研究已有广泛开展，但植物固醇在稳态中的作用仍不清楚。在本研究中，研究人员通过非靶向脂质组学数据挖掘，鉴定出植物固醇硫酸酯（phytosterol sulfates）为微生物群衍生的代谢物。与无特定病原体（specific pathogen-free, SPF）小鼠相比，无菌（germ-free, GF）小鼠粪便中三种主要的植物固醇硫酸酯——谷固醇硫酸酯（sitosterol sulfate, SIS）、菜油固醇硫酸酯（campesterol sulfate, CAS）和豆固醇硫酸酯（stigmasterol sulfate, STS），以及粪甾醇硫酸酯（coprostanol sulfate, CNS）的水平均降低。研究人员鉴定了一系列拟杆菌门（Bacteroidota）物种及其固醇磺基转移酶（sterol sulfotransferases），这些酶比哺乳动物酶更高效地产生植物固醇硫酸酯。此外，SIS以微生物群和年龄依赖的方式显著累积于宿主组织中，而游离的植物固醇则大多检测不到。该研究工作通过肠道细菌的植物固醇代谢，为理解宿主-微生物组相互作用提供了新的见解。

研究背景与科学问题

胆固醇是一种必需的脂质，可调节膜流动性和稳定性，并作为胆汁酸、类固醇激素和维生素D的前体。胆固醇可通过宿主磺基转移酶家族2B成员1（sulfotransferase family 2B member 1）发生硫酸化，形成具有免疫功能的胆固醇硫酸酯（cholesterol sulfate, CS）。植物固醇在C17位烷基侧链结构上与胆固醇存在差异，其代谢动力学也显著不同。约50%的膳食胆固醇被吸收，而仅有约5%的植物固醇通过肠上皮转运蛋白尼曼-匹克C1样1（Niemann-Pick C1-like 1, NPC1L1）进入循环，这主要是由于异二聚体ATP结合盒转运蛋白ABCG5和ABCG8将植物固醇从肠细胞高效排出。因此，植物固醇在哺乳动物组织中的含量极低，不会大量累积。然而，近期研究发现，几种微生物群衍生的脂质能以年龄依赖方式在哺乳动物组织中累积，提示微生物脂质代谢物可能进入并持续存在于宿主体内。尽管如此，植物固醇硫酸酯的组织分布以及微生物群对宿主固醇硫酸酯池的具体贡献仍知之甚少。本研究旨在通过非靶向脂质组学数据挖掘，鉴定植物固醇硫酸酯是否为肠道微生物群衍生的代谢物，并探究其生成的酶学基础和组织分布特征。

研究方法概述

研究人员利用已发表的无特定病原体（SPF）和无菌（GF）小鼠粪便的非靶向脂质组学数据，通过硫酸根离子碎片（m/z = 96.960）的特征进行数据挖掘，鉴定植物固醇硫酸酯。随后，选取10种代表性拟杆菌门（Bacteroidota）物种进行体外培养实验，并通过同源序列比对（BLASTp）鉴定磺基转移酶（sult）基因。采用大肠杆菌（Escherichia coli）异源表达系统表达候选sult基因，并通过体外酶活反应验证其功能。同时，纯化了来自细菌、小鼠和人的重组磺基转移酶，比较其对不同固醇底物的底物偏好性。此外，重新分析了多器官大规模非靶向脂质组学数据集（包含SPF和GF小鼠在不同月龄下的粪便、血浆及多种组织样本），评估植物固醇硫酸酯的组织分布和年龄依赖性变化。人类队列脂质组学数据（来自日本健康体检人群，n=107）也被用于验证这些代谢物在人体中的存在。

研究结果

微生物群来源的固醇硫酸酯的表征

通过重新分析SPF和GF小鼠的粪便脂质组数据，研究人员发现谷固醇硫酸酯（SIS）、菜油固醇硫酸酯（CAS）、豆固醇硫酸酯（STS）和粪甾醇硫酸酯（CNS）在GF小鼠中显著降低。其中，SIS和STS表现出最强的微生物群依赖性，在GF小鼠中分别降低了98.2%和99.2%，而CS丰度未显著减少。抗生素处理的小鼠粪便中也观察到类似趋势，进一步证实了这些植物固醇硫酸酯主要由肠道微生物群产生。

细菌磺基转移酶将谷固醇转化为SIS

在10种测试的拟杆菌门物种中，Parabacteroides goldsteinii、Parabacteroides johnsonii、Bacteroides uniformis、Bacteroides fragilis、Bacteroides caccae和Bacteroides thetaiotaomicron能够同时产生CS和SIS。同源序列比对显示，这六种产SIS的细菌均含有与Parabacteroides merdae sult（pmsult）高度同源的sult基因。通过在大肠杆菌中异源表达这些sult基因，研究人员证实每种磺基转移酶（Sult）都能催化SIS的生成。进一步的底物偏好性实验表明，B. thetaiotaomicron的Sult（BtSult）对所有测试的固醇底物（包括胆固醇、谷固醇、菜油固醇等）均具有活性，但对植物固醇的硫酸化效率高于小鼠和人源的磺基转移酶（mSult2b1b和hSULT2B1b）。

植物固醇硫酸酯的微生物群依赖性组织分布

通过对19月龄雄性小鼠的多组织脂质组数据分析，研究人员发现SIS在肝脏、肾脏、血浆等九种组织中均可检测到，但在皮肤、肠系膜和骨骼肌中未检出。在所有组织中，SIS的强度约为CS的10%。在SPF条件下，SIS水平较GF条件升高超过2倍。STS和CAS也表现出相似的组织分布模式和微生物群依赖性。重要的是，游离的谷固醇、豆固醇和菜油固醇在这些组织中基本低于检测限。此外，饲料中未检测到固醇硫酸酯峰，表明组织中的植物固醇硫酸酯并非来源于饲料，而是由微生物群产生。

植物固醇硫酸酯的年龄依赖性变化

在SPF小鼠中，CS水平在多个器官中未表现出显著的年龄依赖性变化。相反，SIS水平在骨髓、肾脏、肝脏、肺、血浆和脾脏中呈现2至4倍的年龄依赖性增加，在小肠中也有类似的增长趋势。CAS和STS也在多个器官中显示出年龄依赖性增加。这表明SIS、STS和CAS主要由肠道微生物群在肠腔内合成，随后被吸收进入宿主循环，并以年龄依赖方式系统性分布。在人血浆脂质组数据中，研究人员同样检测到了SIS、CAS和STS的信号，进一步支持了这些发现的转化相关性。

讨论与研究结论

本研究表明，通常被认为吸收不良并被宿主高效排出的植物固醇，可以在肠道微生物群的介导下转化为硫酸化形式。其中，SIS在宿主组织中丰度最高，并以年龄依赖方式累积。游离谷固醇在外周组织中基本检测不到，而SIS却呈现广泛的组织分布，且在GF小鼠中显著减少，这揭示了肠道微生物群在塑造宿主固醇硫酸酯池中的重要贡献。这一发现挑战了植物固醇是生物学惰性膳食成分的传统观点，揭示了肠道微生物将膳食固醇转化为可在宿主体内持续存在的代谢物的新途径。

研究人员确认了六种拟杆菌门物种为SIS产生菌，这些菌是人类肠道微生物群的主要成员。SIS在人粪便和血浆中的检出表明其在人体中也存在系统性分布。值得注意的是，克罗恩病（Crohn's disease, CD）患者血清中SIS水平升高，提示其可能作为疾病生物标志物，并与CD相关的肠道菌群失调有关。与BtSult相比，哺乳动物的磺基转移酶对植物固醇的硫酸化效率较低，表明宿主组织中的植物固醇硫酸酯主要来源于肠道微生物群。

关于SIS的年龄依赖性累积机制，虽然尚不完全清楚，但研究数据表明饲料中不含SIS，且产生菌并未随年龄增长而增加。可能的因素包括年龄相关的肠道屏障破坏、消化酶功能下降或肾脏/胆汁排泄功能减弱。基于SIS与CS的结构相似性，SIS可能与CS互作蛋白（如巨噬细胞诱导型C型凝集素Mincle和胞质分裂蛋白2的辅佐因子DOCK2）作为替代配体相互作用。在植物固醇血症（sitosterolemia）中，过量游离植物固醇的累积会导致过早动脉粥样硬化等临床表现，提示SIS的累积也可能对宿主产生不利影响。

总之，本研究通过证明代表性人类肠道细菌能够产生广泛的固醇硫酸酯谱，为这些循环分子的微生物起源提供了实验证据，并为未来的机制研究奠定了基础。阐明SIS的转运、降解和分子靶点对于理解膳食植物固醇、肠道微生物群和宿主代谢如何关联生理与疾病至关重要。