《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Trimethylammonia-lyases of
Shewanella oneidensis and their Role in Anaerobic Respiration
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•希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）基因组中编码的两种裂解酶被生产并进行了表征•这些裂解酶将叶黄素（ergothioneine）和N(π)-甲基组氨酸甜菜碱转化为尿刊酸•所产生的尿刊酸在厌氧呼吸中充当终端电子受体•两种黄蛋白细胞色素c被初步鉴定为偶联的尿刊
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希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）基因组中编码的两种裂解酶被生产并进行了表征
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这些裂解酶将叶黄素（ergothioneine）和N(π)-甲基组氨酸甜菜碱转化为尿刊酸
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所产生的尿刊酸在厌氧呼吸中充当终端电子受体
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两种黄蛋白细胞色素c被初步鉴定为偶联的尿刊酸还原酶
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总之，研究结果揭示了S. oneidensis中的两条能量产生途径
引言
在缺少O2的情况下，许多异养生物利用各种无机化合物和有机化合物作为终端电子受体，从而提高底物分解代谢的能量产出，并使非发酵性底物的生长成为可能 1, 2, 3, 4, 5, 6。尽管从氧化还原电位来看，有机受体的能量产出不如无机受体有利，但有机受体更容易获得，因为它们通常是中心代谢的产物或常见次级代谢物简单转化的结果。例如，富马酸可以从苹果酸、天冬氨酸或酒石酸合成[7]；丙烯酸可从渗透调节物质二甲基砜基丙酸酯获得 5, 8；尿刊酸则可从组氨酸或组氨酸甜菜碱获得 4, 9。
兼性厌氧菌希瓦氏菌MR-1可以利用极其广泛的终端电子受体（Mn(III)、Mn(IV)、Fe(III)、Cr(VI)、U(VI)、富马酸、尿刊酸、硝酸盐、亚硝酸盐、三甲基胺N-氧化物、二甲基亚砜、亚硫酸盐、硫代硫酸盐和单质硫）4, 10, 11，使其成为研究厌氧呼吸的经典模式生物。希瓦氏菌中有机受体的厌氧还原通常由黄蛋白细胞色素c完成，或由使用共价结合的FMN而非血红素作为中间电子受体的功能类似物完成 12, 13, 14。这些蛋白质定位于周质空间，由两个结构域或亚基组成。含FAD的结构域/亚基（Pfam ID: PF00890）负责有机受体的结合与还原，而含血红素C的结构域（黄蛋白细胞色素中的多血红素细胞色素c）或含共价结合FMN的结构域（类似物中的PF04205）则负责将电子从还原当量供体传递至含FAD的结构域。黄蛋白细胞色素及其类似物的还原当量供体通常是呼吸链中的低电位细胞色素c。S. oneidensis MR-1的基因组[11]含有七组编码黄蛋白细胞色素或其类似物的基因：so_0970、so_1413/1414、so_1421、so_3056/3058、so_3300/3301、so_3623/3624和so_4620，其中so_3624可能是一个假基因[15]。在这些基因中，只有两种酶（富马酸还原酶SO_0970 2, 12和尿刊酸还原酶SO_4620 [4]）已在厌氧呼吸中的作用和底物特异性方面进行了表征。因此，其他黄蛋白细胞色素可能使S. oneidensis能够利用尚未鉴定的有机电子受体进行厌氧生长。
两种黄蛋白细胞色素（so_3056/3058和so_3300/3301）的基因位于S. oneidensis染色体上的操纵子中，这些操纵子还包含编码推测的芳香族氨基酸周质氨裂解酶的基因so_3057和so_3299（图1A）。这些酶（PF00221）通常是同型四聚体蛋白，催化组氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸中氨的消除，分别形成尿刊酸、肉桂酸或p-香豆酸[16]。氨裂解酶含有一种独特的亲电辅基——4-亚甲基咪唑-5-酮（MIO），它由保守的Ala-Ser-Gly序列自催化形成[17]。MIO基团对催化至关重要，参与底物α-氨基的移除[18]，并伴随从底物β-碳向氨裂解酶中保守的Tyr残基的质子转移，生成相应的α,β-不饱和羧酸的trans异构体[16]。由于该产物可作为终端电子受体[3]，图1A所示的基因簇可能编码厌氧呼吸中终端电子受体形成的替代途径[11]。
推测的裂解酶SO_3057和SO_3299的氨基酸序列（图1B）与组氨酸氨裂解酶相似。然而，SO_3057和SO_3299与后者酶的不同之处在于缺乏保守的Ala-Ser-Gly序列，而该序列是所有已表征的芳香族氨基酸氨裂解酶中MIO基团形成所必需的。MIO的缺失是三甲胺氨裂解酶（叶黄素酶和组氨酸甜菜碱裂解酶）的特征，这些酶从叶黄素（Erg）或组氨酸甜菜碱（HB）中裂解三甲铵基团（图2）9, 19, 20, 21。SO_3057含有叶黄素酶活性所需的所有氨基酸残基[20]。这些残基包括参与结合底物羧基、咪唑氮原子和巯基团的残基，以及接受来自Erg β-碳原子的质子的Tyr残基（图1B）。基于间接证据，Baran等人提出SO_3057具有叶黄素酶和组氨酸甜菜碱裂解酶活性[22]。然而，该蛋白在S. oneidensis细胞中的底物特异性、催化特性和生理作用在很大程度上仍然未知。
SO_3299蛋白同样含有叶黄素酶活性所需的大部分氨基酸残基（图1B）。然而，SO_3299在对应于齿形密螺旋体叶黄素酶Lys384的位置上有一个中性的Gln434。值得注意的是，Lys残基对于叶黄素的巯基形式形成以及叶黄素酶对巯基团的结合是必需的，其替换导致叶黄素酶活性的丧失[20]。这表明SO_3299的底物可能是一种不含硫原子的叶黄素衍生物，即HB[9]。
本研究聚焦于基因簇so_3056–so_3058和so_3299–so_3301所编码的两种关键酶：三甲胺氨裂解酶SO_3057和SO_3299。我们异源生产了这些酶，并确定了它们的催化特性，包括底物特异性。我们还提供了间接证据，表明这些裂解酶产生的产物为遗传偶联的黄蛋白细胞色素c提供终端电子受体，从而支持S. oneidensis的厌氧呼吸。
章节摘要
材料
叶黄素、L-组氨酸甜菜碱（HB）、N(τ)-甲基-L-组氨酸和N(π)-甲基-L-组氨酸购自中国上海麦克林生化科技有限公司。L-组氨酸甜菜碱的身份和高纯度（>99%）通过质谱分析确认。O-甲基-L-组氨酸购自Sigma Chemical Co.，L-组氨酸购自匈牙利Reanal。
L-组氨酸、HB、O-甲基-L-组氨酸、N(τ)-甲基-L-组氨酸或N(π)-甲基-L-组氨酸的甲基化与
SO_3057和SO_3299蛋白在大肠杆菌细胞中的异源生产
编码截短的SO_3057和SO_3299蛋白（缺乏信号肽）的基因从S. oneidensis基因组DNA中扩增，克隆至表达载体中，并在大肠杆菌细胞中生产相应的蛋白。重组SO_3057和SO_3299蛋白通过 Immobilized Metal Affinity Chromatography（固相金属亲和层析）纯化至电泳均一性（图S1），每升大肠杆菌培养物的产量分别为130毫克和180毫克。获得的条带经质谱分析
讨论
上述结果表征了来自兼性厌氧菌S. oneidensis的两种三甲胺氨裂解酶（SO_3057和SO_3299）的底物特异性和动力学特性。此前已有间接证据表明，SO_3057具有叶黄素酶和组氨酸甜菜碱酶活性[22]。我们的数据确实证明该蛋白能催化从叶黄素中裂解三甲铵基团，产生硫代尿刊酸（图3），其催化
CRediT作者贡献声明
Alexander V Bogachev：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿撰写，方法学，研究，概念构思。Victor A. Anashkin：方法学，研究。Alexander A. Baykov：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿撰写，可视化，数据整理。Marina V. Serebryakova：方法学，研究。Olga S. Godovanets：研究。Yulia V. Bertsova：方法学，研究
利益冲突声明
作者声明，他们与其他人或组织之间不存在可能不当影响或偏倚其工作的财务或个人关系。
资金支持
本研究由莫斯科罗蒙诺索夫国立大学的国家任务资助。
利益冲突声明
作者声明，他们与其他人或组织之间不存在可能不当影响或偏倚其工作的财务或个人关系。
致谢
MALDI MS设施是在莫斯科国立大学发展计划PNG 5.13框架下可用的。我们感谢N.S. Melik-Nubarov博士和M.D. Mamedov博士在甲基化实验方面提供的帮助。
Yulia V. Bertsova|Marina V. Serebryakova|Olga S. Godovanets|Victor A. Anashkin|Alexander A. Baykov|Alexander V. Bogachev
