基于反应速率的全细胞生物转化过程混合机器学习模型的开发

《Biochemical Engineering Journal》：Development of a hybrid machine learning model based on reaction rates for a whole cell biotransformation process

　　

•基于速率的混合模型可以预测细胞生长、产品滴度和反应进度。
•需要更深入的机理细节，即速率而非质量平衡，以确保准确性。
•需要数据驱动的模型组件来捕捉过程复杂性。
•溶解氧、碱添加量和底物初始剂量被用作简单的模型输入。
•用途包括监测、补充或替代分析测试以及获取新数据。
引言
数据驱动模型利用实验或操作数据来预测未来行为。它们可以改善我们对复杂生物过程的理解、优化和控制，在这些过程中我们的机理洞察力很强，但对过程的理解仍不完整。数据驱动模型已被用于预测和监测已知且简单的生物过程，例如准确预测批次培养细菌生长期间的 pH 值 [1]，预测补料分批发酵中酵母的生长速率 [2]，酵母生产乙醇的速率 [3] 或重组产品（如细菌中的 1,3-丙二醇 [4] 或酵母中的乙型肝炎表面抗原蛋白 [5]）的生产速率，以及确定酶反应的最佳条件 [6]。这些进展引发了生物制药行业对采用数据驱动工具的广泛兴趣 [7]、[8]、[9]。然而，数据驱动模型最大的优势之一在于它们描述和建模复杂生物过程的能力，特别是当这些过程无法仅通过机理方程描述时。
在全细胞生物转化过程中，利用天然或基因转化细胞中存在的酶途径，细胞被用于将特定化学化合物转化为具有新功能的结构相关化合物 [10]。这些过程可能涉及顺序 [11]、[12] 或同时 [13] 进行的细胞生长和生物转化，单步或多步酶途径 [14]，并且越来越多地被用于生产一系列分子，包括大宗化学品、增值化学品或活性药物成分 [15]。一个很好的例子是在酵母或细菌中生产苯基异喹啉生物碱 [16]。
最近描述的一个说明全细胞生物转化复杂性的生物过程是原阿片碱的 N-脱甲基化以生产去甲原阿片碱（图 1），这是从原阿片碱生产丁丙诺啡以治疗阿片类药物依赖的关键步骤 [13]。该过程涉及工程酵母细胞的同时补料分批生长（图 1a）以及原阿片碱到去甲原阿片碱的酶促转化（图 1b），由昆虫来源的 N-脱甲基酶（一种细胞色素 P450）催化。酵母细胞还共表达细胞色素 P450 氧化还原酶，该酶催化从 NADPH 到 N-脱甲基酶的电子转移，以及协助原阿片碱摄取进入酵母细胞的嘌呤通透酶，从而实现高效的 N-脱甲基化过程。
原阿片碱的 N-脱甲基化涉及几个动态、非线性和相互依赖的过程，其中一些可以用机理方程描述，而另一些尚未完全理解。富含葡萄糖的培养基通过补料分批加入过程中，随时间推移发酵液体积增加（图 1c），导致酵母指数生长（图 1d）。原阿片碱在过程开始时添加（图 1d），提供同时进行的批次生物转化过程，其中原阿片碱浓度随时间指数下降。去甲原阿片碱产品浓度随时间增加并达到瞬态最大值，但未达到从底物完全转化预期的理论滴度（图 1d），这可能是由于副产物形成或产品降解。在我们先前的工作 [13] 中，通过高效液相色谱我们在 285 nm 和 220 nm 的检测波长处识别出峰，表明生物反应器输出中存在此类副产物。生物转化反应的生产率取决于原阿片碱底物浓度，但高浓度的原阿片碱也会抑制酵母细胞生长 [13]，使最佳条件成为这两个竞争因素之间的权衡。
数据驱动模型不仅能够描述原阿片碱 N-脱甲基化过程中理解良好的部分，例如酵母细胞生长和底物消耗，但也可用于预测理解较少的过程特性，例如由于副产物形成、产品降解和/或其他因素导致的产品滴度和产率损失。此类数据驱动模型可以帮助预测和优化生物过程，补充或替代昂贵且会在过程监测中引入延迟的离线手动分析测量，并可用于潜在地减少过程优化所需的实验次数。
机器学习利用算法来学习数据中的复杂关系，虽然机器学习方法已被应用于描述酶的行为，例如细胞色素 P450 [17]、[18]、[19]，但这些方法尚未被应用于使用细胞内 P450 酶的全细胞生物转化过程，例如原阿片碱的 N-脱甲基化，后者通常更为复杂。全细胞生物转化过程具有显示非线性行为的相互依赖的过程变量。生物转化反应取决于存在的细胞浓度以完成原阿片碱到去甲原阿片碱的转化。细胞数量是细胞随时间生长的函数，然而，有证据表明原阿片碱和去甲原阿片碱（底物和产品）中至少有一种在高浓度下可以抑制细胞生长 [13]。此外，副产物可能来自副反应。这些相互作用的复杂性质使生物转化非常适合机器学习。在可能的机器学习方法中，人工神经网络（ANN）可能对原阿片碱的 N-脱甲基化建模有用，因为这些网络非常适合建模复杂的非线性关系 [8]。人工神经网络已成功用于预测大肠杆菌细胞随温度变化的生长 [20]，以及预测微藻生长期间生物质、硝酸盐和叶黄素浓度的变化速率 [21]。人工神经网络也被用于预测混合培养中有机废物发酵产生的己酸浓度 [22]。
循环神经网络（RNN）在预测时间序列数据方面也前景广阔，生物加工过程中就会出现这种情况 [23]，例如原阿片碱的 N-脱甲基化。该方法克服了在人工神经网络中观察到的一种局限性，即输入和输出数据对之间的相关性不与测量时间相关联。RNN 在隐藏层内添加循环回路算法以保留并将信息传递给下一次预测。这一优势已在酿酒酵母的补料分批发酵中得到证明，其中优化了生物质 [24]，并在平藻束球藻生产藻蓝素的优化生产中也得到了证明 [25]，后者利用 Monod 方程创建生物质、硝酸盐和产物浓度的训练数据。
结合数据驱动和机理组件的混合模型也提供了预测原阿片碱 N-脱甲基化的广泛潜力，因为这些方法已被证明能比纯粹的数据驱动方法提高模型性能 [26]，特别是在数据量小的情况下 [27]。混合模型可以包括质量平衡和动力学方程，或者可以基于从这些机理方程导出的数据进行训练 [28]，将模型限制在已知的物理极限内。增加预测模型中的过程知识程度也可以提高模型准确性、可解释性、超越训练数据集的外推能力并减少过程开发所需的实验工作量 [27]。混合模型可以提供未知速率变量的估计 [29]，例如，一个人工神经网络模型组件已被用于确定酵母生长的特定速率以确定生物质和底物浓度 [30]。当与质量平衡方程一起使用时，人工神经网络模型组件也被用于预测酵母生物质、葡萄糖和乙醇的浓度 [31]。虽然没有能够充分描述原阿片碱生物转化的机理模型，但几个机理方程，例如化学计量关系和质量平衡，可用于描述生物转化反应的某些方面并构建混合模型。
一般来说，更简单的方法，如多变量线性回归（MVL），预计无法有效建模原阿片碱的 N-脱甲基化，包括去甲原阿片碱的瞬态峰值，其幅度和时间取决于多个非线性因素。虽然多变量线性回归通过使用历史数据的校正因子被用于建模细菌细胞生长速率和葡萄糖异构酶生产率 [32]，但普遍认为该技术受限于无法捕捉非线性关系 [33]。先前的比较发现，高级机器学习模型在预测从沼气中去除硫化氢 [34] 和优化微生物生产氢气的培养基方面，相比多变量线性回归提供了卓越的性能 [33]，这加强了多变量线性回归作为主要用于比较分析的简单控制工具的作用。
本研究旨在评估是否可以使用数据驱动方法对全细胞生物转化过程进行建模，例如原阿片碱的 N-脱甲基化，包括同时细胞生长、原阿片碱消耗以及去甲原阿片碱产品和任何副产物生产的复杂动态。模型的主要目标是预测这些变量的非线性行为，包括去甲原阿片碱产品浓度的瞬态峰值和副产物形成。本文探讨并比较了不同数据驱动机器学习方法的相对性能，包括人工神经网络和循环神经网络，并与多变量线性回归进行了比较。还探讨了更详细的混合模型，将人工神经网络与机理质量平衡方程或基于速率的方法相结合，这些方法描述了生物转化反应的已知方面，以评估额外的过程知识是否能提高模型预测的准确性。本研究评估了简单的在线过程数据和模型预测是否可能补充或替代离线过程监测，并提供了新的透明混合模型，整合了描述生物转化的机理关系。
章节片段
实验数据收集
所有生物转化实验均在 5 L 生物反应器（Sartorius Biostat APlus, Sartarius Stedim Australia）中进行，使用工程化酿酒酵母（S. cerevisiae），详细的培养和使用生物转化过程描述见我们之前的研究 [13]。简言之，该过程使用初始 8 小时的批次培养，随后是 62 小时的补料分批培养，使用含有 620 g/L 葡萄糖的富含葡萄糖的培养基。培养基进料速率逐步增加并保持
特征选择
为了评估预测酿酒酵母细胞生长（通过 OD600）和生物转化反应进度（通过底物原阿片碱浓度，[Ori] 和产品去甲原阿片碱浓度，[NorO]）的最佳输入，首先检查了增强数据集中特征之间的相关性。
在特征之间观察到几个强相关性。这包括向生物反应器添加的总富含葡萄糖培养基与 OD600 之间的强相关性（r= 0.86）以及总量
结论
开发了一个基于速率的混合模型，混合模型 II，用于预测酵母细胞生长和同时进行的原阿片碱到去甲原阿片碱的全细胞生物转化进度，这是生产丁丙诺啡以治疗阿片类药物依赖的关键 N-脱甲基化步骤。该模型可以预测细胞密度和原阿片碱底物浓度随时间的变化，以及更复杂的特征，包括去甲原阿片碱产品和副产物的浓度。该
资金致谢
Sally Gras 和 Sandra Kentish 报告获得了 River Stone Biotech ApS 和 River Stone Biotech Australia Pty Ltd 提供的财政支持。这些公司的员工未参与本文中描述的任何模型的开发或其解释。他们在提交前审阅手稿仅以确认未披露机密公司信息。所有其他作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人
CRediT 作者贡献声明
Siyi Xue: 写作 – 审阅与编辑，方法论，形式分析。Nyssa Nair: 写作 – 初稿，方法论，调查，形式分析，概念化。Sally Gras: 写作 – 审阅与编辑，监督，项目管理，方法论，资金获取，概念化。Xu Li: 写作 – 审阅与编辑，监督，方法论，概念化。Sandra Kentish: 写作 – 审阅与编辑，监督，概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些关系可能会影响本文报告的工作。
Nyssa Nair|Siyi Xue|Xu Li|Sandra Kentish|Sally Gras