基于pH依赖抗体工程策略靶向BIGH3/TGFBI以缓解实体瘤抗原沉没并提高治疗指数

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Targeting BIGH3 in selected solid tumors through a pH-Dependent antibody engineering strategy

　　

靶向实体瘤中高丰度基质抗原常受到抗原沉没（antigen sink）效应限制，该效应降低治疗暴露并损害疗效。转化生长因子β诱导蛋白ig-h3（TGFBI/BIGH3）是一种分泌型细胞外基质（ECM）蛋白，在多种恶性肿瘤中过表达并参与肿瘤进展和免疫调节，但其高循环水平对基于抗体的靶向治疗构成重大挑战。在此，研究人员报告，结构表征提示BIGH3在模拟肿瘤微环境（TME）的条件下寡聚化增加，而未检测到抗体结合和亲和力（平衡解离常数（K_D）或半数最大有效浓度（EC₅₀））的丧失。研究人员还证明，pH敏感抗BIGH3抗体可经工程化改造，使其在模拟TME的酸性条件下优先结合，同时在生理pH下降低结合。通过迭代人源化、寡聚化评估、可结晶片段区域（Fc）优化和结构指导的突变，研究人员生成了在肿瘤相关条件下具有稳健结合且在pH中性时亲和力降低的变体。生物物理分析证实其稳定性和可制造性特征得以保留，体外研究证明pH依赖性靶标结合，体内研究显示在结直肠癌小鼠模型中具有抗肿瘤作用。这些发现支持一种通过利用肿瘤相关pH梯度来减轻抗原沉没的策略的可行性，尽管直接的体内药代动力学（PK）、生物分布和肿瘤蓄积研究仍有待开展。总之，这项工作为开发靶向实体瘤中高表达细胞外抗原的条件性活性抗体提供了概念验证（PoC）框架，并强调pH依赖性工程化是提高治疗指数的潜在可推广方法。

论文解读

研究背景与问题：实体瘤治疗耐药与肿瘤微环境（TME）复杂性密切相关，TME含免疫抑制细胞和致密基质成分。BIGH3又称TGFBI，是转化生长因子β诱导的68 kDa细胞外基质（ECM）蛋白，在胰腺导管腺癌（PDAC）、膀胱癌、结直肠癌（CRC）、肝细胞癌（HCC）和黑色素瘤等TME中过表达，与疾病进展相关。BIGH3含分泌信号序列、N端富含半胱氨酸结构域、四个fasciclin-1域和RGD（Arg-Gly-Asp）细胞黏附基序；RGD可与整合素α_Vβ₃和α_Vβ₅结合，促进迁移、增殖和生存，并与胶原等ECM成分相互作用，参与纤维重组和基质刚度增加。至今尚无靶向BIGH3的单克隆抗体（mAb）在人体中评估。BIGH3在健康组织广泛表达，且循环水平可达μg/ml，高于VEGF或HER2等靶标常见的pg/ml或ng/ml水平，因而存在on-target off-tumor毒性和抗原沉没风险。酸性TME（pH约6–6.9）与生理pH约7.4的差异，为开发pH依赖抗体提供了机会。研究人员因此研究BIGH3构象、肿瘤表达模式及pH依赖抗体靶向可行性，以提高治疗指数。

研究概况与意义：研究人员确认BIGH3在健康组织组成型表达，并在PDAC和CRC肿瘤组织中显著上调；健康个体和癌症患者均存在高循环BIGH3。研究人员开发了全人源抗BIGH3 mAb 18B3.H330，发现循环中BIGH3多为单体，而在TME模拟条件下更倾向寡聚化，且未损害抗体结合。通过Fc段新生儿Fc受体（FcRn）增强突变和pH依赖工程，研究人员获得在生理pH降低结合、在酸性TME条件下保留可测亲和力的变体，并在结直肠癌小鼠模型中显示抗肿瘤作用。该工作为靶向高表达细胞外抗原的条件性活性抗体提供了概念验证框架，但仍需直接体内PK、生物分布和肿瘤蓄积研究。

关键技术方法：采用免疫组织化学（IHC）和人体组织微阵列（TMA）评估健康与肿瘤组织BIGH3表达；ELISA定量人血清BIGH3，样本来源为健康供者（n=10）、PDAC（n=5）、CRC（n=15）和黑色素瘤（n=14）患者，样本来自Clinisciences和Proteogenex；通过Western blot、动态光散射（DLS）和G.validation评估BIGH3寡聚化；以ELISA和表面等离子体共振（SPR-Biacore）分析pH 6.0/7.4下抗体结合及FcRn结合；对鼠源18B3进行测序、嵌合化、CDR移植人源化，并进行Fc工程（LALA LS/LALA YTE）和结构指导Fv突变；在CHO/ExpiCHO中表达纯化，用SEC-HPLC、SDS-PAGE、DSC/UNcle评估稳定性；在B6-hTGFBI敲入小鼠接种MC38结直肠肿瘤，静脉10 mg/kg每周给药，评估肿瘤体积、体重和生存。

研究结果：
3.1 BIGH3在健康组织中高表达：通过IHC评估广泛健康组织，显示几乎所有测试组织呈高等级染色；通过ELISA定量血清，PDAC患者较健康供者显著升高，CRC和黑色素瘤患者无显著增加；通过TMA IHC显示PDAC和CRC患者基质BIGH3面积比例较健康供者增加，黑色素瘤和膀胱癌无显著差异。
3.2 设计并表征来自鼠源18B3的人源化抗BIGH3抗体：研究人员对鼠源18B3测序，完成嵌合化，再通过CDR移植进行人源化，产生9个变体；根据结合、人源化率和稳定性选择H-330-V1/L-41-V1并命名为18B3.H330；多批次显示相似生物学特性和性能，稳定性与可制造性经热稳定性、强制脱酰胺、强制氧化、酸性pH、搅拌和冻融等验证。
3.3 BIGH3作为癌症免疫治疗候选靶点：18B3.H330靶向BIGH3的FAS1-4域，靠近RGD基序，涉及胶原和整合素结合；通过Western blot、DLS和G.validation显示，BIGH3在TME模拟条件下较中性或循环条件呈更高寡聚化状态。
3.4 环境和寡聚化对18B3.H330结合BIGH3的影响：SPR显示pH 6.0平均K_D为5.47×10^?11 M，pH 7.4平均K_D为9.03×10^?10 M，酸性条件下亲和力略高；ELISA显示TME环境EC₅₀为0.1 nM，低于其他环境；总体未显示显著差异，说明寡聚化未显著影响抗体结合。DLS显示抗体结合未显著改变颗粒大小，提示其作用机制不基于诱导BIGH3二聚化。
3.5 18B3.H330优化和新变体产生：Fc段引入LALA LS或LALA YTE后，纯度、单体比例和稳定性与亲本相当，FcRn结合增强约8–10倍，由较慢解离驱动，且BIGH3结合不受影响。第一轮筛选43个单His Fv变体，分三组；第二轮生成54个含LALA YTE的Fv变体，选出9个重链和9个轻链候选，最终选择B-H9、B-L7和B-L25。纯化后B-H9在pH 7.4无结合，在pH 6.0的K_D为4.82×10^?9 M；B-L7和B-L25在pH 7.4低信号或无K_D，在pH 6.0保留结合。ELISA对细微动力学差异不如SPR敏感，B-H9等在两pH下EC₅₀可比。
3.6 18B3.H330A和一个选定变体B-H9的生物学效能：在B6-hTGFBI小鼠中，该模型表达人TGFBI且鼠Tgfbi缺失，接种MC38结直肠肿瘤。18B3.H330A（18B3.H330加YTE LALA突变）达45%肿瘤生长抑制（TGI）（Day 12），混合效应模型显示显著治疗×时间交互，生存趋势p=0.077；B-H9达49% TGI（Day 23），治疗×时间交互显著，生存趋势p=0.309；两组体重无显著变化。研究未定义精确作用机制（MoA），也未直接证明改善PK、减少系统抗原沉没、增加肿瘤蓄积或靶点占据。

讨论部分总结：研究人员讨论认为，BIGH3在健康组织广泛表达且循环水平高，支持抗原沉没风险；其在PDAC和CRC等肿瘤中上调，支持治疗相关性。18B3.H330保留结合、可开发性和稳定性；TME样条件下寡聚化未显著影响表位可及性，但该条件为人工近似，需SEC-MALS、native PAGE、交联或组织确认。pH依赖变体在生理pH降低结合，在酸性条件保留结合；Fc修饰减弱Fc效应功能并保留FcRn回收。ELISA反映静态平衡，不如SPR实时动力学敏感。研究未直接证明体内减少可溶BIGH3结合、PK、生物分布、靶点占据和肿瘤暴露。B6-hTGFBI模型因18B3.H330识别人BIGH3而不识别鼠BIGH3被选择；MC38细胞为鼠源，未评估其鼠Tgfbi表达，可能成为混杂因素。LALA突变最小化Fc效应，抗肿瘤活性不太可能来自抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）或补体依赖的细胞毒性（CDC），更可能为TME中BIGH3功能中和。机制尚未完全阐明，研究人员提出FAS1/RGD与整合素/胶原相互作用、基质组织、刚度和CAF/TAM相关免疫抑制等非互斥可能，但未直接研究。局限包括无PK和靶点占据数据、寡聚化需原生确认、MoA未直接证明、仅雌性小鼠、主要来自CRC模型。

研究结论翻译：总之，本研究证明工程化pH依赖抗BIGH3抗体具有可行性，该抗体在酸性条件下保留结合，同时在生理pH下降低结合。该工作为靶向选定BIGH3高表达肿瘤中高丰度基质抗原提供了概念验证策略。在更全面评估该方法及抗BIGH3抗体最终临床评价潜力之前，仍需进一步临床前研究，尤其需解决上述局限性，并进行全面的PK和安全性表征。