新型口服临床前 PolC 抑制剂候选抗生素在中性粒细胞减少小鼠大腿 MRSA 感染模型中保留肠道微生物组厌氧群落与发酵能力：与 linezolid 的比较研究

《Microbiology Spectrum》：The effects of novel oral preclinical PolC inhibitor antibiotic candidates on the gut microbiome in a murine thigh infection model

　　

抗生素可能对肠道微生物组（gut microbiome）组成和功能产生负面影响。然而，抗生素对微生物组影响的临床前评估很少开展。本研究的目的是在中性粒细胞减少小鼠大腿感染模型中，表征 PolC（DNA polymerase IIIC）抑制剂化合物与 linezolid 相比的药代动力学（pharmacokinetics，PK）和宏基因组谱。中性粒细胞减少小鼠大腿接种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA），并在 1 h 后开始口服给予 ACX-728、ACX-801、ACX-978 或 linezolid。未治疗对照小鼠在 1 h 被安乐死以获取基线数据，第二个未治疗组在给药开始后 24 h 被安乐死，此时所有剩余小鼠均被安乐死。安乐死时，切除大腿肌肉用于 MRSA 定量，并收集粪便颗粒、结肠组织和血浆样本用于药物浓度和微生物组分析。所有 PolC 抑制剂在 25 h 时可在血浆和粪便中检测到。与 linezolid 相比，PolC 抑制剂在该急性小鼠感染模型中维持了更高的肠道微生物丰富度和多样性。PolC 处理样本保留了整体群落结构和 Bacteroidota 优势，而 linezolid 引起显著破坏，并伴随 Pseudomonadota 的二次扩增，主要为 Escherichia coli。微生物通路分析显示 PolC 抑制剂保留了群落水平代谢功能，而 linezolid 造成显著破坏。与对照相比，linezolid 使 MRSA 每克菌落形成单位（colony-forming unit，CFU/g）降低 4.4 log，而 PolC 抑制剂在各组中产生平均 0.4–2.5 log 降低。在这些探索性研究中，PolC 抑制剂化合物保留了厌氧群落结构和发酵能力，而 linezolid 诱导健康共生菌耗竭和耐氧类群扩增。这些发现强调了在临床前研究中进行微生物组知情抗生素评估的重要性。需要更大规模临床前和临床研究以证实这些发现。重要性：本研究作为系统性 PolC 抑制剂临床前开发计划的一部分，评估了 PolC 抑制剂对微生物组的类效应。与不可吸收抗生素 ibezapolstat 类似，这些新化合物对微生物组观察到窄谱影响。

一、研究背景与问题

人类肠道微生物组（gut microbiome）是由细菌、古菌、真核生物和病毒组成的复杂群落，作为代谢器官参与不可消化多糖发酵、必需维生素和生物活性代谢物合成，并调节免疫和维持肠黏膜屏障完整性。肠道微生物组破坏与代谢紊乱、慢性炎症性疾病和自身免疫病症等相关。抗生素可深刻影响肠道微生物组组成和功能，且这种影响具有药物依赖性。例如，azithromycin 可降低微生物丰富度并增加耐药组负担，meropenem、gentamicin 和 vancomycin 联合可导致 Enterobacterales 和 Enterococcus faecalis 过度生长以及 Bifidobacteria 等健康共生菌耗竭。然而，新抗生素在临床前阶段的微生物组评价很少开展。

PolC（DNA polymerase IIIC）是 Bacillota（低 G+C 含量革兰阳性菌）门的主要复制性 DNA 聚合酶，包括艰难梭菌（Clostridioides difficile）、Staphylococcus spp.、Streptococcus spp. 和 Enterococcus spp. 等临床重要病原体。革兰阴性和高 G+C 含量革兰阳性类群不依赖 PolC 进行 DNA 复制，真核生物也不含 PolC，因此 PolC 是革兰阳性细菌抗生素开发的优良靶点。Ibezapolstat（IBZ）是首创 PolC 抑制剂，对艰难梭菌感染（Clostridioides difficile infection，CDI）有临床活性，具有高肠道暴露和有限系统暴露，对肠道微生物组破坏有限，优于口服 vancomycin。新型 PolC 抑制剂 ACX-801、ACX-728 和 ACX-978 由 IBZ 结构衍生，处于临床前开发，优化了溶解度、口服生物利用度并扩大抗革兰阳性病原体活性。研究目的是在中性粒细胞减少小鼠大腿耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）感染模型中，比较这些 PolC 抑制剂与 linezolid 的肠道药代动力学（pharmacokinetics，PK）和宏基因组谱，检验微生物组保护是否为类效应。

二、关键技术方法

采用中性粒细胞减少小鼠大腿 MRSA 感染模型。雌性 CD-1 小鼠来自 Charles River Laboratories，实验在 AAALAC 认证的 NeoSome Life Sciences 开展，经 IACUC 批准（NLS24-011）。小鼠经环磷酰胺诱导中性粒细胞减少，右后大腿肌内接种 MRSA BAA-1717（USA 300），最终 1.8 × 10⁵ CFU/大腿。感染后 1 h 口服给药：ACX-728、ACX-801、ACX-978 各 100 和 150 mg/kg，每日三次，共 1 天；linezolid 100 mg/kg，每日两次，共 1 天。设基线、未治疗、6 个 PolC 抑制剂组和 linezolid 组。除基线于 1 h 安乐死外，其余 25 h 安乐死。收集大腿、血浆、结肠和粪便。关键技术为液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）药代分析、定量 PCR（qPCR）检测总细菌和 Bacillota DNA、鸟枪法宏基因组测序及 BioBakery/MetaPhlAn/HUMAnN 分析，统计采用 R 线性模型、Shannon 指数和 Bray–Curtis/非度量多维尺度分析（NMDS）。下游 n=33。

三、研究结果

1. PolC inhibitors achieved good plasma and intestinal exposure at 25 h（PolC抑制剂在25 h达到良好的血浆和肠道暴露）。通过 PK 分析，所有 PolC 抑制剂在 25 h 的血浆和粪便中可检测到。ACX-801 在两个剂量水平血浆浓度最高，约比 ACX-728 和 ACX-978 高一个数量级；其中位（四分位距，IQR）血浆浓度在 100 mg/kg 为 22,920（18,350–27,560）ng/mL，150 mg/kg 为 35,300（29,990–37,010）ng/mL。粪便中 ACX-801 150 mg/kg 为 4,766 μg/g，ACX-728 150 mg/kg 为 312 μg/g，ACX-978 100 mg/kg 为 252 μg/g。因粪便剂量可得性不同，未进行统计比较。

2. PolC inhibitors preserved bacteroidota-dominated community structure（PolC抑制剂保留以Bacteroidota为主的群落结构）。通过 qPCR 和宏基因组分析，未治疗对照组总细菌 DNA 与基线相当，表明时间和感染本身未实质性改变肠道微生物生物量。抗生素暴露降低总细菌 DNA，Bacillota 门降幅最大；PolC 抑制剂对总细菌和 Bacillota DNA 的耗竭在数值上小于 linezolid，但差异无统计学显著性。PolC 抑制后 observed richness 和 Shannon 多样性降低幅度小于 linezolid。基于 Bray–Curtis 相异度的 NMDS 显示，PolC 抑制剂样本聚集于基线和对照附近，而 linezolid 样本沿主轴分离。未治疗组以 Bacteroidota（约 60%）和 Bacillota（约 40%）为优势门。PolC 抑制剂保留 Bacteroidota 优势，尤其是 Muribaculaceae 和 Bacteroidaceae，以及纤维发酵类群 Muribaculum、Duncaniella 和 Phocaeicola vulgatus，并伴随 Akkermansia muciniphila 扩增。相反，linezolid 引起 Bacteroidota 和 Bacillota 显著耗竭，继发 Pseudomonadota 扩增，以 Escherichia coli 为主。

3. PolC inhibitors preserved key anaerobic metabolic activity（PolC抑制剂保留关键厌氧代谢活性）。通过 HUMAnN 功能通路分析和 NMDS，PolC 抑制剂处理小鼠功能谱与对照重叠，linezolid 处理小鼠沿主轴单独聚类。相对于基线，PolC 抑制维持或富集淀粉降解、丙酮酸发酵为丙酸等厌氧代谢通路。Linezolid 处理小鼠显示广泛代谢通路耗竭，包括核黄素和腺苷钴胺素（维生素 B₁₂ 活性形式）生物合成通路降低。

4. PolC inhibitors reduced MRSA burden in the neutropenic mouse thigh model（PolC抑制剂降低中性粒细胞减少小鼠大腿模型中的MRSA负荷）。通过大腿 CFU 计数，治疗开始时 MRSA 平均负荷为 5.45 log₁₀ CFU/g 大腿，25 h 时未治疗组增加 3.23 log₁₀。PolC 抑制剂剂量间无一致剂量-反应关系，合并剂量后相对于未治疗组降低 0.53–1.91 log₁₀ CFU/g（Holm 校正 P<0.05）；linezolid 降低 4.05 log₁₀ CFU/g（Holm 校正 P<0.0001）。

四、讨论与结论

讨论指出，PolC 抑制是靶向低 G+C 革兰阳性菌 DNA 复制的策略，IBZ 临床中相对 vancomycin 保留微生物组。本研究中 ACX-801 血浆浓度达 20–35 μg/mL，超过主要革兰阳性病原体最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）1–4 μg/mL，支持 PK/药效学目标达成可能性；三种化合物均降低 MRSA，但效应小于 linezolid，提示进一步结构或给药优化可能增强组织水平疗效。宏基因组分析将 PolC 抑制剂与 linezolid 区分：PolC 抑制剂保留 Bacteroidota 和 SCFA 产生相关 Muribaculaceae，linezolid 促进兼性厌氧 Escherichia 和 Parasutterella。功能上，PolC 抑制剂保留淀粉降解和丙酮酸至丙酸通路，linezolid 抑制核黄素和 B₁₂ 合成。SCFA 支持屏障、免疫和代谢，Akkermansia muciniphila 与代谢改善相关，Parasutterella 与代谢功能障碍相关。局限包括中性粒细胞减少模型影响、单 25 h 时间点、linezolid 每日两次而 PolC 抑制剂每日三次、未观察到 Lachnospiraceae 和 Oscillospiraceae 保护、HUMAnN 为遗传能力推断、可能因肠道暴露低、样本量小，故为探索性。

研究结论翻译：抗生素对肠道微生物组产生药物依赖性影响，这些影响超出传统微生物学谱。尽管 PolC 抑制剂化合物和 linezolid 均靶向革兰阳性生物，它们产生不同宏基因组特征，最可能与其不同作用机制有关。PolC 抑制剂诱导靶向革兰阳性抑制，同时保留厌氧群落结构和发酵能力，而 linezolid 耗竭革兰阳性和革兰阴性专性厌氧菌并促进耐氧类群扩增。这些发现强调微生物组知情抗生素评估的重要性。需要更大规模临床前研究和临床研究以证实这些发现。