利用细胞内固态核磁共振研究噬菌体诱导的鳗弧菌鳗弧菌亚种膜扰动

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes》：Probing bacteriophage-induced membrane perturbation in Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida by in-cell solid-state NMR

　　

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  噬菌体是有前景的抗生素替代品。
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  体内²H NMR揭示了噬菌体感染期间的膜变化。
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  噬菌体感染在细菌裂解之前改变了膜动力学。
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  A层调节膜对噬菌体感染的响应。
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  膜组织与噬菌体易感性相关。

引言

脓疮病是影响鲑形目鱼类养殖的主要细菌性疾病。该病由革兰氏阴性兼性厌氧杆菌鳗弧菌亚种鳗弧菌（Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida）引起，可导致致命的败血症或形成称为脓疮的皮下脓肿，使受感染的鱼类不适合食用 [1]。在高密度养殖条件下，鱼类密度高会加速疾病传播并导致高死亡率 [2]。鳗弧菌亚种鳗弧菌的致病性依赖于多种毒力因子，其中三型分泌系统（T3SS）和A层发挥核心作用 [1]。T3SS是一种针状结构，可将效应蛋白直接转运至宿主细胞内，干扰吞噬作用和细胞凋亡等免疫功能 [3]。A层是一种准晶面表面蛋白阵列，覆盖脂多糖（LPS）和外膜，有助于细菌保护及其与环境的相互作用 [4]。当细菌在高于25°C的温度下培养时，由于基因组改变，T3SS和A层均可不可逆地丢失 [5]、[6]、[7]。

目前脓疮病的治疗主要依赖抗生素；然而，抗生素的密集使用已导致细菌种群中抗生素耐药性的出现，并引发了对环境和公共卫生影响方面的担忧 [8]、[9]、[10]。噬菌体是特异性感染并裂解细菌细胞的病毒，为病原体控制提供了精准手段 [11]、[12]、[13]。多项研究表明，基于噬菌体的治疗在减少细菌负荷和改善感染鱼类存活率方面具有潜力 [10]、[11]、[13]、[14]。在鳗弧菌亚种鳗弧菌中，已分离并表征了多种裂解性噬菌体，包括SW69–9，这是一种具有拉长衣壳和收缩尾的肌尾噬菌体，能够感染广泛的鳗弧菌亚种鳗弧菌菌株 [15]、[16]。然而，噬菌体-宿主相互作用的分子决定因素仅得到部分阐明：迄今鉴定出的主要涉及LPS和A层 [15]、[17]、[18]，以及在海生鳗弧菌菌株中的LPS生物合成基因、外膜蛋白和双组分系统 [19]，而噬菌体受体结合蛋白、吸附后起作用的主机因子，以及这些机制在亚种和生活方式间的适用范围，在很大程度上仍不清楚。

噬菌体感染始于对位于细菌细胞表面的特异性受体的吸附。在鳗弧菌亚种鳗弧菌中，LPS已被鉴定为噬菌体55R-1和SW69–9的受体 [14]、[20]。然而，A层可以限制对LPS的接触，因为它可能遮蔽底层的LPS，从而限制噬菌体吸附 [4]。这种效应似乎是噬菌体依赖性的：A层对于噬菌体LPM4的吸附并非必需，但似乎促进了其感染 [17]，而噬菌体T7-Ah对敏感菌株的可变吸附则无法与功能性A层的存在相关联 [18]。

Paquet等人利用鳗弧菌亚种鳗弧菌对热应激的敏感性，从亲本菌株M15879–11产生了缺乏功能性T3SS的非毒力菌株 [15]。其中包括保留完整A层的AS-R3，以及由于vapA基因突变而缺乏A层的AS-R5。随后从AS-R5衍生出噬菌体不敏感突变体BIM93，该突变体携带影响LPS生物合成的突变，因此也缺乏A层。利用这些菌株，研究证明LPS可作为噬菌体SW69–9的受体，未表征蛋白ASA_1998也参与感染过程。比较吸附实验进一步表明，SW69–9对缺乏功能性A层的AS-R5的吸附率高于对A层阳性的野生型菌株M15879–11。这些结果表明，A层并非作为噬菌体SW69–9的受体，而是作为限制LPS接触的物理屏障发挥作用 [15]。

除受体识别外，噬菌体感染还涉及与细菌包膜的密切相互作用，可能伴随膜组织的变化 [21]。在革兰氏阴性菌中，膜性质如脂质组成和流动性影响膜通透性、蛋白活性和对外部应激的响应 [22]。由于噬菌体感染的第一步发生在细胞表面，膜组织可能影响细菌对噬菌体吸附和感染的易感性。反过来，噬菌体结合和感染可能扰乱细菌膜的物理状态。因此，研究膜流动性可以作为一种补充吸附研究的替代方法，并可能提供关于噬菌体-细菌相互作用如何影响感染期间细菌包膜的见解。

氘核固态核磁共振（²H ssNMR）是一种强大的无创技术，用于研究完整细菌膜中的脂质动力学。该方法提供了脂质酰链有序度和动力学的原子级信息，并已被Marcotte等人成功用于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和光合弧菌的体内膜研究 [23]、[24]、[25]、[26]。为此，细菌在氘代脂肪酸（如全氘代棕榈酸，d₃₁-PA）存在下培养，这些脂肪酸被整合入内源性磷脂或被动整合入膜中 [24]、[26]。所得²H ssNMR谱图以四极裂分为主，直接反映膜脂有序度，并可揭示外部因素引起的微妙扰动。

在本研究中，我们利用²H ssNMR调查了噬菌体SW69–9与三个鳗弧菌亚种鳗弧菌菌株之间的相互作用：AS-R3（噬菌体敏感、A层阳性）、AS-R5（噬菌体敏感、A层阴性）和BIM93（噬菌体不敏感、A层阴性、LPS生物合成改变）[15]。我们假设细菌包膜的结构差异可影响噬菌体吸附效率和膜流动性。通过在胞内监测这些效应，本研究旨在确定SW69–9如何影响鳗弧菌亚种鳗弧菌的膜组织，并为噬菌体-细菌相互作用提供新的见解。

章节摘要

材料

氘代棕榈酸（d₃₁-PA）、油酸（OA）、贫氘水和脂肪酸甲酯（FAME）混合物C4-C24购自Sigma-Aldrich（加拿大安大略省Oakville），EDTA购自Fisher Scientific（美国新泽西州Fair Lawn）。Tween-20购自BioShop Canada Inc.（加拿大安大略省Burlington），胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）和胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）购自Wisent Inc.（加拿大魁北克省Saint-Jean-Baptiste）。

细菌菌株和噬菌体

鳗弧菌亚种鳗弧菌菌株AS-R3、AS-R5和

鳗弧菌亚种鳗弧菌膜的磷脂和脂肪酸组成

为了通过²H ssNMR调查噬菌体SW69–9与鳗弧菌亚种鳗弧菌菌株AS-R3（A层阳性、噬菌体敏感）、AS-R5（A层阴性、噬菌体敏感）和BIM93（A层阴性、噬菌体不敏感）之间的相互作用，我们首先改编了此前为革兰氏阴性菌大肠杆菌开发的²H标记方案 [29]。将细菌细胞与d₃₁-PA和OA的悬浮液共孵育，并用Tween 20胶束化以促进脂肪酸（FA）的整合

讨论

在本研究中，我们通过体内²H ssNMR调查了噬菌体SW69–9与三个鳗弧菌亚种鳗弧菌菌株膜之间的相互作用。这些菌株包括噬菌体敏感的AS-R3和AS-R5，它们分别具有和缺乏A层，以及噬菌体不敏感的BIM93突变体，该突变体缺乏A层并携带影响LPS生物合成的突变。我们首先开发了一种使用d₃₁-PA和OA将氘代脂肪酸（FAs）整合入细菌

结论与展望

在本研究中，我们采用体内²H ssNMR方法监测完整鳗弧菌亚种鳗弧菌细胞在暴露于噬菌体SW69–9期间的膜脂质动力学。氘标记方案使d₃₁-PA能够高效整合入细菌膜中，同时不显著改变整体磷脂组成，为追踪水生细菌活体中的膜有序度提供了合适的平台。

三个菌株对SW69–9显示出不同的膜响应。

CRediT作者贡献声明

Rana Moussaoui：撰写-初稿，可视化，验证，方法学，调查，形式化分析，数据整理。Stéphane Beauclercq：撰写-审阅与编辑，监督，调查，数据整理。Valérie E. Paquet：撰写-审阅与编辑，监督，方法学，调查，数据整理，概念化。Alexandre A. Arnold：撰写-审阅与编辑，验证，监督，方法学，调查，形式化分析，概念化。Steve J. Charette：

资金

本研究由魁北克研究基金（FRQ）-自然与技术（拨款编号326941）、加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）（拨款编号RGPIN-2024-05667）以及FRQ研究网络魁北克水资源（RAQ，拨款编号2026-RS7-377424）资助。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。资助方未参与本研究的设计、数据收集、分析或解释、论文撰写或发表决策。

致谢

本研究得到魁北克研究基金（FRQ）-自然与技术（拨款编号326941）和加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）（授予I.M.，拨款编号RGPIN-2024-05667）的支持。我们感谢Dror Warschawski博士（巴黎索邦大学，法国）的专业知识及其富有洞察力的讨论。我们还感谢Violaine Ponsin教授（蒙特利尔魁北克大学，加拿大魁北克省蒙特利尔）提供GC–MS仪器的使用权以及

Rana Moussaoui|Stéphane Beauclercq|Valérie E. Paquet|Alexandre A. Arnold|Steve J. Charette|Isabelle Marcotte