多组学揭示复发性艰难梭菌感染（rCDI）缓解与代谢网络恢复而非供体微生物定植相关

《iScience》：Metabolic network restoration, not donor microbial engraftment, associates with resolution of recurrent Clostridioides difficile infection

　　

粪便微生物移植（fecal microbiota transplantation，FMT）可有效预防复发性艰难梭菌（Clostridioides difficile）感染（recurrent Clostridioides difficile infection，rCDI）。然而，支撑FMT疗效的机制尚未被完全理解。研究人员采用邻近连接宏基因组学（proximity-ligation metagenomics）、宏蛋白质组学（metaproteomics）和代谢组学（metabolomics）描绘rCDI中的动态变化。研究人员分析了在一项比较两种基于供体治疗（冻干FMT [lyophilized FMT，LFMT]或冻干无菌粪便滤液 [lyophilized sterile fecal filtrate，LSFF]，不含完整微生物）以预防rCDI的临床试验中，前7例应答者采集的样本。与LFMT相比，LSFF富含Caudoviricetes、脂质、脂肪酸以及人源和胞外细菌蛋白。LFMT接受者出现供体微生物定植，而LSFF接受者仅实现部分微生物群落恢复且无供体贡献。研究人员的多组学分析识别出两种治疗后出现功能趋同，从氧化和抗生素应激生存途径转向增强的碳-氮利用途径，提示FMT机制可能涉及代谢重编程和宿主-微生物氨基酸共代谢。研究人员的发现提供了重要的假设生成性见解，值得进一步验证。

研究背景与问题。复发性艰难梭菌感染（recurrent Clostridioides difficile infection，rCDI）是抗生素相关菌群失调中最顽固的例子。标准治疗如万古霉素可抑制C. difficile，但也会侵蚀提供定植抵抗的共生群落，使患者陷入复发循环。每次复发加重发病率、抗菌暴露和医疗负担，因此需要恢复微生物和代谢稳态的策略。粪便微生物移植（fecal microbiota transplantation，FMT）是指南推荐疗法，具有持久应答，但其恢复肠道健康的机制仍不清楚。供体微生物定植曾被认为处于核心地位，依据是成功治疗后微生物多样性增加并出现供体样群落组成。然而，一项5例rCDI患者研究报道无菌粪便滤液有效，提示活供体微生物可能并非严格必需，这挑战经典替换模型，并提示恢复肠道功能可能是主要治疗驱动。肠道生态系统是动态多层网络，微生物、病毒和宿主代谢紧密交织。短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）、胆汁酸和氨基酸衍生物调节上皮屏障完整性、免疫张力以及C. difficile萌发和毒素活性。噬菌体和移动遗传元件塑造生态演替并通过水平基因转移恢复代谢功能。捕捉这些层次在rCDI及其缓解中的重构需要系统层面视角，超越传统分类学分析。研究人员近期完成一项大型随机试验（n = 138），比较冻干FMT（lyophilized FMT，LFMT）和冻干无菌粪便滤液（lyophilized sterile fecal filtrate，LSFF）预防rCDI。LSFF通过一系列过滤至最小孔径0.2 μm去除活菌后冻干，因此缺乏LFMT中存在的活微生物。LSFF预防rCDI效果为65%，低于全谱LFMT的88%，但不能排除代谢物、噬菌体和胞外蛋白等成分在无供体微生物定植时贡献临床获益。因此，研究人员分析该试验前7例参与者在第0周（W0）和第24周（W24）的配对粪便样本，探究这两种根本不同治疗如何重塑rCDI缓解期间的肠道生态系统。研究人员采用多组学方法，结合邻近连接（Hi-C）宏基因组学、宏蛋白质组学和靶向代谢组学，识别通过不同生态路径实现的功能恢复和趋同。该框架用于判断rCDI缓解是否反映宿主-微生物代谢网络重编程，而非简单供体微生物替换，从而为下一代微生物组治疗提供机制见解。

关键技术方法概括。样本来源于一项比较LFMT与LSFF预防rCDI的随机临床试验（n = 138）中前7例成功应答者，其中4例LFMT、3例LSFF，均接受单一健康供体制造的研究性产品，采集W0和W24配对粪便。关键技术包括邻近连接（Hi-C）宏基因组学用于菌株水平、病毒-宿主连接和功能潜力分析；宏蛋白质组学分析微生物、人、病毒和质粒蛋白；化学同位素标记液相色谱-质谱代谢组学（chemical isotope labeling liquid chromatography-mass spectrometry，CIL LC-MS）靶向胺/酚和羧基代谢物；并结合Kraken2、MetaPhlAn4、GTDB-Tk、Meta4P、MetOrigin等生物信息学流程。

研究结果。第一，无细菌粪便滤液（LSFF）产品含极少量非活菌细菌DNA。通过Kraken2和MetaPhlAn4两种宏基因组流程，LSFF中细菌总读数比LFMT少74.71%，细菌丰富度分别降低54%和90.1%，痕量信号以Oscillospiraceae为主；革兰染色和培养组学未检测到微生物或生长。因此，LSFF中检测到的细菌读数可能代表胞外DNA片段或非活菌细胞碎片。第二，与LFMT相比，LSFF显示富集噬菌体多样性。宏基因组分析显示LSFF病毒序列丰富度较LFMT高6倍，病毒群落以Caudoviricetes为主，最丰富噬菌体为Klebsiella phage VLCpiS11a（23.6%），其次为Raoultella virus ro1（1.5%）和Junduvirus communis（0.4%）。第三，LFMT和LSFF处理后细菌群落组装遵循不同轨迹。W0时LFMT接受者细菌丰富度和多样性显著降低，W24时二者增加并接近供体水平，PCoA显示向供体簇移动；LSFF接受者W24仅部分恢复丰富度和多样性，向供体谱移动较弱。Venn图和基因组热图显示，LFMT组有14个细菌谱系在供体和W24接受者中存在而W0缺失，部分平均核苷酸一致性（average nucleotide identity，ANI）>0.995，包括Alistipes putredinis、Evtepia gabavorous、Adlercreutzia celatus_A、Alistipes finegoldii、Coprococcus A catus、Agathobacter rectalis和Blautia stercoris，支持供体菌株定植；LSFF组仅4个细菌分类单元共享，ANI相似性有限，提示部分恢复主要由内源或环境获得分类单元驱动，并富集可介导水平基因转移的非原噬菌体元件。第四，噬菌体-宿主关联遵循不同分化模式。通过量化病毒contig连接中W24接受者与供体是否共享相同预测细菌宿主，LFMT接受者多数噬菌体-噬菌体连接保持相同预测宿主物种，3/4接受者宿主一致率超过60%，宿主改变几乎限于厚壁菌门（Firmicutes）内Lachnospiraceae、Oscillospiraceae和Ruminococcaceae等近缘分类单元；LSFF接受者同宿主连接更异质，LSFF1为0%、LSFF2为61.8%、LSFF3为17.2%，且LSFF3出现涉及拟杆菌门（Bacteroidota）的宿主转变。第五，LFMT和LSFF后功能趋同反映核心微生物功能恢复独立于供体定植。功能宏基因组分析显示，W24时LFMT和LSFF接受者均向供体功能簇移动，两组共有22个新获得功能，但新获得供体样功能并非主要来自高ANI供体菌株，而多与低ANI细菌谱系相关；LSFF中N-乙酰葡糖胺利用和多个糖转运系统持续与低ANI分类单元关联，提示恢复微生物组存在功能冗余。第六，微生物群蛋白质组丰富度增加，W24通过恢复氧化应激和氨基酸代谢功能趋同。宏蛋白质组鉴定18,690个蛋白组，W24时两组丰富度恢复至供体水平，主要由微生物蛋白表达增加驱动，人蛋白组数量稳定。KEGG分析显示W0富集应激和生存通路，包括双组分调节系统、RNA降解、生物膜形成、β-内酰胺耐药、氧化磷酸化和乙醛酸/二羧酸循环；W24转为碳固定、ABC转运、辅酶A生物合成和2-氧羧酸代谢，尤其氨基酸生物合成和降解通路，如支链氨基酸、半胱氨酸和精氨酸代谢。酶水平上，W0过表达过氧化物酶、过氧化氢酶和歧化酶，W24逆转。分类-功能分析显示W0主要由Klebsiella、Escherichia、Anaeroglobus和Bacteroides贡献，W24富集Phocaeicola、Anaerobutyricum、Blautia、Eubacterium和Paraprevotella等功能。第七，LSFF处理保留人源和胞外微生物蛋白。产品宏蛋白质组定量2,844个蛋白组，其中1,149个为LFMT独有，85个为LSFF独有，1,470个共享；LSFF缺乏微生物蛋白组使人蛋白含量相对富集，包括免疫球蛋白。共享微生物蛋白具有胞外功能，如鞭毛/菌毛运动、溶质结合、碳水化合物分解和细菌Ig样（Big）结构域蛋白；共享人蛋白富集消化、抗菌防御反应和组织稳态功能。第八，rCDI缓解涉及广泛宿主-微生物群氨基酸共代谢。CIL LC-MS检测7,237个独特峰对，其中1,660个被高置信鉴定；W0与W24比较发现1,504个代谢物增加、826个减少，主要变化为二肽和三肽、氨基酸及衍生物、胆汁酸、SCFA和维生素B相关代谢物。W24小肽如leucyl-lysine、tyrosyl-glycine和threoninyl-methionine显著升高，SCFA包括丙酸和丁酸增加；W0则多胺如尸胺和腐胺升高。MetOrigin分析将8个代谢物归为宿主来源，83个为微生物来源，70个为宿主-微生物共代谢；通路富集显示仅4个宿主特异通路显著改变，而59个共代谢和38个微生物相关通路富集，半胱氨酸和蛋氨酸代谢是宿主、微生物和共代谢三类共有的唯一通路。宿主富集通路包括花生四烯酸代谢、胆汁酸生物合成和β-丙氨酸代谢；微生物和共代谢通路主要涉及精氨酸和脯氨酸、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸以及支链氨基酸生物合成。19种蛋白氨基酸热图显示L-精氨酸、苏氨酸、丝氨酸和谷氨酸在W24升高，而半胱氨酸、丙氨酸和甘氨酸在W0最高。第九，LSFF产品代谢复杂性较低但富含肽、短链和中链脂肪酸及脂质。比较7,237个峰对，3,692个代谢物在两种产品中相对浓度相似；LFMT在1,860个代谢物中更丰富，LSFF在1,685个中更丰富。LSFF含高浓度胆烷酸异构体或衍生物，并在二肽和三肽、氨基酸及衍生物、脂质、短链和中链脂肪酸方面显著多于LFMT。

讨论部分总结。研究人员的初步多组学研究表明，LSFF产品虽缺乏LFMT中活供体细菌，但富含噬菌体以及微生物源和人源蛋白与代谢物。比较成功接受两种治疗的rCDI患者样本后发现，持久疾病缓解伴随肠道微生物组代谢功能恢复；尽管组成轨迹不同，两种干预均趋同于氨基酸代谢、氧化还原平衡和宿主-微生物共代谢恢复。这些观察与如下模型一致：rCDI缓解与代谢网络重编程相关，该重编程可能通过多种生态过程产生，包括供体微生物定植、胞外微生物产物和代谢物，以及内源或环境获得细菌活性。宏基因组、宏蛋白质组和代谢组提示微生物组成与功能恢复之间存在一定解耦；功能趋同提示肠道微生物组具有功能冗余。从氧化应激和生存通路向厌氧、营养加工功能的协调转变，提示重建有利于定植抵抗并抑制C. difficile过度生长的代谢生态位。氨基酸代谢，尤其是支链氨基酸、半胱氨酸和精氨酸通路，成为连接宿主和微生物共代谢的主要轴。噬菌体和其他后生元成分也可能贡献临床效应。研究强调，FMT的经典“替代”模型可能需要扩展，功能性恢复可能是微生物组治疗的关键终点；氨基酸和氧化还原相关代谢特征可能作为治疗监测生物标志物或未来合成菌群和明确后生元制剂的靶点。研究局限包括样本量小、无安慰剂对照、未纳入治疗失败者、仅分析W0和W24、仅使用单一供体，因此结果应视为假设生成性，需在更大队列及体外和体内实验中验证。

研究结论部分翻译：研究人员的多组学初步研究为rCDI中FMT疗效的潜在机制提供了额外见解。尽管LSFF产品缺乏LFMT中存在的活供体细菌，但其富含噬菌体以及微生物源和人源蛋白与代谢物。通过比较成功接受任一治疗的rCDI患者样本，研究人员观察到持久疾病缓解伴随肠道微生物组代谢功能恢复。尽管组成轨迹不同，两种干预均趋同于氨基酸代谢、氧化还原平衡和宿主-微生物共代谢的恢复。这些观察与如下模型一致：rCDI缓解与代谢网络重编程相关，该重编程可能通过多种生态过程产生，包括供体微生物定植、胞外微生物产物和代谢物，以及内源或环境获得细菌的活性。研究人员的发现提供了重要的假设生成性见解，值得进一步验证；这些可能性需要在更大队列和实验系统中验证，之后才能确立其治疗相关性。