《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics》：Rational attenuation of elapid long-chain neurotoxin by targeted residue substitution and disulfide architecture simplification: implications for receptor interaction and immune recognition
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•表达了两款含有二硫键桥接的眼镜蛇科长链神经毒素重组蛋白。•变体rLcNTx V1以可溶性形式回收，而rLcNTx V2仅以包涵体形式存在。•无论是变体rLcNTx V1还是rLcNTx V2，均未观察到通道阻断作用。•rLcNTx V1和rLcNTx V2均具有免疫原性，并
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表达了两款含有二硫键桥接的眼镜蛇科长链神经毒素重组蛋白。
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变体rLcNTx V1以可溶性形式回收，而rLcNTx V2仅以包涵体形式存在。
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无论是变体rLcNTx V1还是rLcNTx V2，均未观察到通道阻断作用。
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rLcNTx V1和rLcNTx V2均具有免疫原性，并能产生识别多种眼镜蛇科长链神经毒素的抗体。
引言
眼镜蛇科短链和长链神经毒素是蛇毒中最强效的成分之一，通过极低浓度下与神经型和肌型烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的高亲和力相互作用发挥毒性作用[1]、[2]。在长链神经毒素（LNTx）中，受体识别由一组明确定义的保守决定簇介导，包括介导与nAChR静电相互作用的碱性残基（Lys23、Arg33、Arg36和Lys49）、稳定复合物的芳香族残基（Phe29），以及由多个二硫键维持的结构支架[3]、[4]。这种精确的分子组织通过紧密且选择性的受体阻断，实现了对猎物快速、高效的神经肌肉麻痹，反映了毒素-受体相互作用的功能性优化，而非整体蛋白折叠的改变[3]、[4]、[5]。
尽管LNTx具有重要的生物学意义，但其某些固有特征限制了其在常规抗蛇毒血清生产中的应用。其分子量小、在蛇毒中含量低以及显著的种内变异，阻碍了产生强效、广谱中和体液免疫反应的形成[6]、[7]、[8]。因此，异源表达系统和蛋白质工程策略已成为制备毒素衍生免疫原的替代方法。大肠杆菌已被广泛用于神经毒素及相关肽段的重组表达[6]、[7]、[9]。然而，富含半胱氨酸的神经毒素的表达存在实际操作上的局限性，限制了适合免疫的变体的稳定生产[9]。
对具有减毒特性的LNTx变体进行理性工程改造，是开发更安全性免疫原的一种有前景的策略。一种方法是在对nAChR识别至关重要的、高度保守的碱性残基（如Lys23、Arg33、Arg36和Lys49）处引入定点突变，以削弱毒素-受体相互作用，同时保持整体分子框架和相关抗原决定簇[3]、[10]、[11]。该策略还可能允许在免疫方案中使用更高的抗原剂量，而不会损害安全性。
另一种较少探索的策略则聚焦于修饰LNTx特征性的二硫键构型。特别是，由半胱氨酸对Cys26和Cys30形成的第五个二硫键，被认为参与神经型nAChR的识别和受体亚型选择性[3]、[10]、[12]、[13]。完全去除包含这些半胱氨酸残基的片段，为研究简化的二硫键构型如何影响毒素-受体相互作用和免疫原特性提供了机会。其他三指毒素的研究为此提供了支持，这些毒素尽管含有较少的二硫键，但仍能保持稳定的折叠构象和抗原特性[14]、[15]、[16]。我们没有将Cys残基突变为Ser或Ala（这会在Loop II末端留下一个无锚定、高度灵活且构象不稳定的环），而是设计了一个5个残基的截短（从Cys30到Cys34）。该策略旨在优雅地去除二硫键，同时模拟稳定天然短链α-神经毒素中发现的较短Loop II结构，从而最大限度地减少整体结构无序性。
在本研究中，我们通过设计和表征两种源自共识长链神经毒素的重组变体来检验这两种策略。一种变体在参与nAChR识别的关键碱性残基（即Lys23、Arg33、Arg36和Lys49，分别对应LcNTx共识序列中的Lys26、Arg36、Arg39和Lys52位置）处引入了电荷反转突变；另一种变体则缺失了与第五个二硫键对应的整个片段，包括Cys26和Cys30（分别位于LcNTx共识序列中的Cys29和Cys33位置）。通过对这些变体进行功能和免疫学分析，我们旨在确定特定的结构修饰如何影响毒素-受体相互作用，并评估其作为减毒免疫原在开发下一代抗蛇毒血清中的潜在应用。
各节摘录
蛇毒
粗制冻干蛇毒从各种来源获得。来自金环蛇（Ophiophagus hannah）（923.090）、黑曼巴蛇（Dendroaspis polylepis）（218.020）、泰曼蛇（Naja kaouthia）（506.000）和黑领眼镜蛇（Naja nigricollis）（105.030）的蛇毒从Latoxan（法国瓦朗斯）购得。此外，来自印度环蛇（Naja melanoleuca）、莫桑比克眼镜蛇（Naja mossambica）、埃及眼镜蛇（Naja haje）、滑鼠蛇（Aspidelaps lubricus）、太攀蛇（Acanthophis antarcticus）和白环蛇（Bungarus candidus）的蛇毒，以及α-银环蛇毒素（Sigma，美国）和欧洲沙漠蝎（Buthus occitanus）毒液，用作对照，由某博士慷慨提供。
共识序列及rLcNTx V1和V2的重组表达
我们通过修改此前报道的长链α-神经毒素共识序列[9]，生成了两种变体。在变体1中，仅在已知的对神经型和肌型烟碱型乙酰胆碱受体识别至关重要的碱性残基（根据经典比对命名法为Lys23、Arg33、Arg36和Lys49）处引入了定点突变。具体而言，在绝对共识序列中，Lys26、Arg36、Arg39和Lys52被替换为谷氨酸（Lys26Glu，
讨论
长链神经毒素在眼镜蛇科蛇毒中含量有限，历史上限制了其在传统抗蛇毒血清制剂中的作用，从而推动了对异源表达系统进行毒素合成的研究[8]、[9]、[10]、[23]。尽管大肠杆菌（E. coli）仍然是三指毒素表达中最常用的宿主之一，但其合成天然富二硫键构象的能力有限，构成了一项重大限制[10]、[23]、[24]。
结论
长链α-神经毒素是高度受限的富含半胱氨酸蛋白质，其中有限的一组表面残基和二硫键共同决定了受体结合、生物活性和免疫原性。在本研究中，我们对一种共识长链α-神经毒素进行了两种理性工程改造，以剖析电荷重新分布和二硫键构型如何影响重组表达和免疫识别。
在保守碱性残基处的电荷反转突变，它们
CRediT作者贡献声明
Víctor Carpanta：方法学、调查研究、形式分析、数据管理、概念构思。Ivan Arenas：方法学、数据管理、概念构思。Herlinda Clement：验证、监督指导、方法学、形式分析、数据管理。Estuardo López-Vera：验证、方法学、调查研究、形式分析。Gerardo Corzo：写作——审稿与编辑、写作——初稿撰写、项目管理、调查研究、经费获取、概念构思。
伦理声明
本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经生物技术研究所批准（批准编号：IT200321-411）。
致谢
感谢生物技术研究所DNA合成与测序单元的Paul Gaytán博士、M.C. Eugenio López-Bustos和Q.I. Santiago Becerra，以及Fernando Zamudio博士在质谱测定方面提供的协助。我们还感谢Ricardo Mondragón先生和BSc. Felipe Olvera在抗体纯化方面提供的支持。此外，我们感谢Oswaldo López、Sergio González、BSc. Graciela Cabeza和DVM Elizabeth Mata来自
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