一种用于检测变形链球菌的快速特异性RAA-CRISPR/Cas13a检测方法

《Biochimie》：A Rapid and Specific RAA-CRISPR/Cas13a Assay for Detecting Streptococcus mutans

　　

# 首次应用RAA-CRISPR/Cas13a检测系统用于变异链球菌检测

• 改变crRNA的序列可检测不同细菌
• 检测范围为10 CFU/mL至10? CFU/mL，检测限为3.2 CFU/mL
• 一种用于龋齿风险筛查的快速、设备简便的即时检测工作流程

## 引言

变异链球菌是引发龋齿的主要致龋细菌，龋齿是全球最常见的慢性疾病之一。该病的特征为牙齿硬组织（釉质、牙本质和牙骨质）的脱矿和破坏。龋病病变可发生于多种牙面，包括牙冠（尤其在窝沟处）和牙根面[1]。据估计，全球超过三分之一的人口和60%至90%的学龄儿童受到龋齿影响[2]。世界卫生组织已将龋齿与癌症和心血管疾病并列为主要可预防的非传染性疾病[3]。若不经治疗，龋齿进展将导致龋洞形成、牙齿断裂，最终导致牙齿丧失，严重影响患者生活质量[4], [5]。龋齿及其并发症的治疗对个人、家庭和医疗系统造成巨大经济负担；此外，预防策略在成本效益方面显著优于修复治疗[6]。

在原核生物（如细菌和古菌）中，CRISPR-Cas系统充当适应性免疫防御。根据效应复合体的结构组织方式，这些系统从根本上分为两大类。I类系统采用多亚基复合体进行靶标干扰，这种结构增加了其处理和实际使用的复杂性。相反，II类系统以单一的、多结构域效应蛋白（如Cas9、Cas12或Cas13）的参与为特征，简化了基因修饰操作，并推动了其在生物技术中的广泛应用[7]。近年来，CRISPR-Cas系统的可编程特性（尤其是II类效应蛋白）已被用于核酸检测[8]。该方法通过优越的特异性和更高的灵敏度克服了传统分子诊断的若干不足，提供了极具前景的替代方案。因此，大量研究工作集中于将CRISPR-Cas与等温扩增技术相结合以创造新型诊断工具[9], [10]。这一趋势主要由对快速、用户友好且设备需求少的即时检测（POC）检测方法的迫切需求所驱动。这些组合系统通常将等温预扩增阶段与CRISPR介导的识别相结合，在检测速度、灵敏度和对资源有限环境的适应性方面通常超过传统PCR——这些特性对快速诊断应用至关重要[11]。

VI-A型CRISPR-Cas系统的标志性效应蛋白Cas13a被表征为一种由RNA引导的核糖核酸酶（RNase），通过RNA结合而被激活[12], [13]。它首先与包含重复区和间隔区的 precursor CRISPR RNA（pre-crRNA）结合，并在重复区段内进行切割，从而产生成熟的CRISPR RNA（crRNA）。加工后的crRNA仍与Cas13a结合，形成一种被称为Cas13a:crRNA二元复合体的催化沉默核糖核蛋白装配体[14], [15]。对互补RNA激活剂的识别会触发复合体的结构重排，激活其两个HEPN（高等真核生物和原核生物核苷酸结合）结构域的酶功能，导致无差别RNA降解（附带切割）。最近推出的基于CRISPR的诊断工具SHERLOCK被设计为等温运行——例如在37°C[16]。这种温度无关特性支持创建高度节能且可能无需仪器的检测平台，大大增强了其野外适应性。因此，SHERLOCK能够迅速、精确且超灵敏地识别核酸靶标，为病原体检测建立了突破性的方法学框架[17]。

首先，Cas13效应蛋白因其高灵敏度和高特异性而成为分子诊断的有力工具。这种效用源于其独特的附带切割活性：在识别并切割其靶RNA后，激活的Cas13蛋白非特异性地降解周围RNA分子，从而充当强大的信号放大器。研究人员利用这一附带切割活性开发了新一代核酸检测技术，如SHERLOCK平台[18]。在SHERLOCK平台中，靶RNA首先被等温扩增，然后使用Cas13蛋白进行检测。

其次，Cas13可实现精确的RNA操作并具有治疗应用前景。与传统DNA编辑工具（如Cas9）不同，Cas13在RNA水平上发挥作用。这种活性是短暂的，不会改变基因组，从而为治疗由异常RNA引起的疾病提供了优越的安全性[19]。与传统核酸检测方法（如PCR）相比，CRISPR-Cas系统在检测效率和特异性方面具有显著优势。然而，CRISPR-Cas系统的主要局限性在于，在没有预扩增步骤的情况下，其固有灵敏度不足以实现稳健检测，这限制了其在病原体诊断中的应用[20]。因此，核酸扩增是CRISPR检测测定必需的先决条件。等温扩增与crRNA引导的Cas激活的整合有效减少了假阳性信号，同时显著增强了特异性和准确性[21]。总之，RAA-Cas13a平台利用重组酶辅助扩增（RAA）实现靶核酸的高效、快速和等温扩增，消除了对传统PCR所需热循环仪的依赖。结合Cas13a蛋白的高特异性及其附带切割活性带来的信号放大作用，这一整合创建了一个以超高灵敏度、卓越特异性和快速工作流程为特征的强大有分子诊断平台。因此，RAA-Cas13a系统建立了一个稳健的平台，成功利用了Cas13a技术，凸显了其在推进下一代即时检测（POCT）和居家诊断应用方面的重大潜力[9]。

目前，LAMP和CRISPR/Cas12a是变异链球菌的主要等温检测系统，而我们建立的RAA-CRISPR/Cas13a检测方法与两种方法均存在核心差异。与基于LAMP的方法相比，我们的检测方法仅需一对引物即可实现等温扩增，避免了多种引物之间固有的非特异性相互作用缺陷。同时，Cas13a介导的序列识别提供了第二层特异性，降低了单一等温扩增系统的假阳性风险[2], [4]。与CRISPR/Cas12a系统相比，两个平台在机制上存在根本差异。Cas12a靶向双链DNA，且激活严格需要PAM序列，限制了靶位点选择灵活性。相比之下，Cas13a识别RNA靶标不依赖于PAM，使得可以灵活选择高度特异性的保守位点，并在激活时通过其附带RNA切割活性实现信号放大。此外，在RAA正向引物中嵌入T7启动子使得扩增产物可直接进行体外转录，无需额外修饰步骤，简化了工作流程[25]。

本研究首次开发了一种基于RAA-CRISPR/Cas13a的生物传感器，用于特异性检测变异链球菌（图1）。首先，采用重组酶辅助扩增（RAA）快速扩增靶DNA片段。在该系统中，正向引物的5′端设计了T7启动子序列，使RAA扩增产物可直接作为后续体外转录的模板。扩增后，对产物进行纯化，随后与转录试剂（包括T7 RNA聚合酶）孵育，以合成相应的RNA。随后，该RNA被Cas13a-crRNA二元复合体特异性识别并结合，从而激活Cas13a蛋白的横切割活性。激活的Cas13a随即非特异性地切割系统中存在的单链RNA（ssRNA）报告分子。该报告分子5′端标记FAM荧光基团，3′端标记BHQ1淬灭基团。切割使荧光基团与淬灭基团分离，产生可实时检测的荧光信号。该过程实现了对靶分子的高灵敏度和定量分析。因此，我们建立了一个整合RAA与CRISPR-Cas13a的新型平台，用于快速和超灵敏检测，旨在满足临床诊断和变异链球菌检测的需求。该方法不仅有助于龋齿的防控，还拓展了RAA和CRISPR-Cas13a系统的应用范围。

## 试剂、材料和设备

本研究中使用的所有寡核苷酸均购自上海生工生物工程有限公司（中国上海）。本研究使用的寡核苷酸序列见表S1。重组酶辅助扩增（RAA）试剂盒购自江苏启天基因生物科技有限公司（中国）。LwaCas13a及其配套的10× HOLMES反应缓冲液均购自拓朴生物（上海，中国）。若干酶和RNA处理试剂购自美国新英格兰生物实验室（NEB，美国）。

## 可行性分析

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）验证了RAA产物的成功扩增（图1A）。设计了一对特异性引物靶向变异链球菌基因组DNA的独特区域，生成长度为352 bp的双链扩增产物。第1-3道分别加载了各组分：RAA-F引物、RAA-R引物和变异链球菌基因组DNA。在顶部观察到一个与预期352 bp RAA扩增产物对应的清晰亮带。

## 结论

本研究成功建立了一种基于RAA-CRISPR/Cas13a系统的快速、高效、灵敏和特异性的变异链球菌检测方法，为龋齿早期诊断提供了有力工具。通过整合重组酶辅助扩增（RAA）与CRISPR-Cas13a技术，该系统实现了对变异链球菌核酸的等温扩增和高特异性识别。该检测方法的检测限低至3.2 CFU/mL，具有从……的宽线性范围。

## CRediT作者贡献声明

Zhang Anling：监督，项目管理。Wan Jiayu：撰写—审阅与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念构思。Wang Qingshuang：监督，项目管理。Qiu Sha：验证。Liu Lijun：方法学。Xu Chuanna：可视化，方法学。Xue Shixing：可视化，方法学。Sun He：可视化，调查。Bu Shengjun：可视化，调查。Zhang Xingdong：撰写—原始草稿，方法学，数据管理。

## 利益冲突声明

作者声明他们不存在任何已知的竞争经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。

## 数据可用性

数据应要求提供。

## 利益冲突声明

作者声明他们不存在任何已知的竞争经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。

## 致谢

本研究得到吉林省科技发展计划（YDZJ202401021ZYTS）的资助。

Zhang Xingdong | Bu Shengjun | Sun He | Xue Shixing | Xu Chuanna | Liu Lijun | Qiu Sha | Wang Qingshuang | Wan Jiayu | Zhang Anling