急性髓系白血病患者自身来源与供体来源的T细胞耗竭微环境的单细胞解析

《iScience》：Single-cell dissection of self-derived versus donor-derived T cell exhaustion niches in patients with acute myeloid leukemia

　　亮点：
- 多组学分析揭示了AML移植前后免疫抑制性骨髓微环境的变化
- 不同的NFAT中心转录程序区分了自身来源和供体来源的CD8+ Tex细胞
- 免疫抑制性单核细胞、树突状细胞（DCs）和调节性T细胞（Tregs）在自身来源和供体来源的骨髓中积累
- AML细胞通过半乳糖凝集素-9（galectin-9）、MIF和TGF-β1与CD8+ Tex细胞进行直接和间接相互作用

摘要：
复发仍是急性髓系白血病（AML）患者死亡的主要原因，T细胞耗竭与非同种移植和同种移植环境中的复发均有关。然而，不同疾病背景下耗竭T细胞（Tex）的差异尚未完全理解。我们通过单细胞RNA测序和T细胞受体（TCR）测序系统地表征了AML中的Tex细胞。无论是非移植状态下的自身来源Tex细胞还是移植后的供体来源Tex细胞，都表达相似的表面标记物，但自身来源Tex细胞中NFATC1/NFATC3及其下游因子TOX和EOMES富集，而供体来源Tex细胞中则以NFATC2及其下游因子NR4A2为主。自身来源和供体来源的骨髓环境中均富含免疫抑制性单核细胞、树突状细胞和调节性T细胞。细胞间相互作用分析显示，Tex细胞与AML细胞之间存在强烈的直接和间接相互作用，主要通过半乳糖凝集素-9、MIF和TGF-β1介导。这些发现强调了自身来源和供体来源Tex细胞之间的差异和共性，并确定了逆转AML中Tex细胞的潜在治疗靶点。

引言：
急性髓系白血病（AML）是一种异质性的恶性克隆性疾病，严重威胁人类健康。尽管靶向治疗和异种干细胞移植（allo-SCT）的应用改善了AML患者的预后，但大多数患者最终仍会复发，5年生存率仅为30%。细胞毒性CD8+ T细胞是癌症免疫治疗的支柱。在慢性炎症和肿瘤条件下，如果靶细胞的清除失败且T细胞受体（TCR）信号持续激活，T细胞可能会“耗竭”，其特征是抑制性受体（如PD-1、TIM-3、LAG-3和CTLA-4）的高表达。T细胞耗竭不仅与化疗和靶向治疗中的复发或难治性（R/R）疾病有关（自身来源的耗竭T细胞 Tex），还可能与ALSO-SCT情况下的AML复发相关（供体来源的Tex细胞）。尽管之前已有研究描述了AML中的CD8+ Tex细胞和免疫抑制性髓系细胞，但自身来源和供体来源Tex细胞在转录程序及其与白血病细胞的相互作用方面的相似性和差异仍不甚清楚。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和免疫分析技术的发展使我们能够在转录和TCR水平上全面分析肿瘤微环境，从而探讨细胞表型和分子调控机制。据我们所知，此前尚无研究使用scRNA-seq系统比较R/R AML中白血病细胞与自身来源和供体来源CD8+ Tex细胞之间的耗竭相关调控程序和细胞通信网络。

研究方法：
我们利用ALSO-SCT平台结合scRNA-seq和scTCR-seq，系统地分析了R/R AML患者骨髓中的CD8+ T细胞耗竭情况。我们发现，自身来源的Tex细胞（移植前）与供体来源的Tex细胞（移植后）具有不同的转录网络：自身来源Tex细胞富集NFATC1/NFATC3、TOX和EOMES相关的转录程序，而供体来源Tex细胞则富集NFATC2和NR4A2相关的调控特征。两组细胞均处于一个富含单核细胞、树突状细胞（DCs）和调节性T细胞（Tregs）的免疫抑制性微环境中。研究观察到，Tex细胞与AML细胞之间通过半乳糖凝集素-9、MIF和TGF-β1发生强烈的直接和间接相互作用。我们的研究确定了TOX、NR4A2、半乳糖凝集素-9、MIF和TGF-β1作为缓解AML中T细胞耗竭的潜在治疗靶点。

结果：
- 对四位AML患者在移植前后的免疫细胞和类白血病细胞亚群进行了全面的单细胞图谱分析。
- 在移植前未缓解（NR）（组1）和移植后复发（组2）两个疾病阶段对患者进行了追踪（图1A和S1A及数据S1）。我们构建了包含95,426个细胞的基于图谱的聚类用于细胞类型注释（图S1B）。
- 首先分别分析每位AML患者与四位健康供体（HDs）的样本（见STAR方法和图S1C–S1I）；综合结果显示图1B和图1C。该分析发现24,463个T细胞、14,709个髓系细胞（单核细胞、DCs等）和37,134个类白血病细胞。两组患者的骨髓中T细胞比例均显著低于健康供体（图1D和S2A）。

- 根据先前的研究和标记基因分析（图S2B和数据S2），我们将白血病细胞分为造血干细胞（HSC）样 blasts、祖细胞样 blasts、粒细胞-单核细胞祖细胞（GMP）样 blasts、活跃分裂的 blasts、红系样 blasts、自然杀伤（NK）样 blasts和DC样 blasts（图1E和1F）。HSC样 blasts的17个白血干细胞基因（LSC17）得分最高（图S2C）。伪时间分析显示HSC样 blasts向其他blast亚型的分化过程（图1G）。差异表达基因（DEG）分析和基因本体论（GO）富集分析表明，与非HSC样 blasts相比，HSC样 blasts上调了白细胞增殖、造血调节和免疫系统过程负调控相关通路（图S2D和数据S3）。先前的研究表明，肿瘤细胞分泌或表达MIF、TGFB1、LGALS9和HLA-E等分子可促进T细胞或NK细胞耗竭。我们发现，与非HSC样 blasts相比，HSC样 blasts上调了MIF、TGFB1、LGALS9和HLA-E的表达水平，下调了HLA II类分子的表达水平（图1H）。组2中HSC样 blasts和祖细胞样 blasts的比例高于组1（图1I），且HSC样 blasts的LSC17得分显著高于组1（图S2E）。这些结果表明，具有增强的干细胞潜力和免疫抑制能力的HSC样 blasts可能导致移植后复发。鉴于HLA II类下调在移植后免疫逃逸中的作用，我们比较了两组间HSC样 blasts的HLA II类表达情况。结果表明，HLA-DR表达上调，而HLA-DP和HLA-DQ表达下调（图S2F）。这些发现表明，组2中的抗原呈递相关改变可能是分子特异的，而非普遍抑制的。

- 在AML移植受者中鉴定出的Tex细胞簇包括两个幼稚型簇（CD4+和CD8+）、两个记忆型簇（CD4+和CD8+）以及三个效应型簇（CD4+、CD8+和NKT）（图2A和2B）。T细胞亚型还包括调节性T细胞（Tregs）、黏膜相关不变T细胞和γδ T细胞。另外，三个T细胞簇表现为高表达抑制性受体（如PDCD1、LAG3和TIGIT），定义为IRhigh T细胞簇（CD8+、CD4+和NKT）（图2B）。我们发现，两组患者骨髓中CD8+效应型T细胞（Teff）和CD8+ IRhigh T细胞的比例高于健康供体（图2C和S3A）。

- T细胞克隆分析显示，高度扩增的细胞亚群主要集中于组1和组2的CD8+ Teff和CD8+ IRhigh簇中，而克隆扩增有限的细胞群体主要分布在幼稚型和记忆型簇中（图2D、S3B和S3C）。CD8+ Teff和CD8+ IRhigh T细胞之间存在强相关性（图S3D和S3E）。计算得出的配对转移指数（pIndex.tran）表明CD8+ Teff和CD8+ IRhigh T细胞具有最高的配对转移可能性（图2E）。定量分析显示，与CD8+ Teff相比，CD8+ IRhigh T细胞表达了较低的GZMB、PRF1和TUBB水平，但表达了较高的抑制性受体（如TIGIT）和转录因子（如TOX和NR4A2）水平（图2F和S3F）。在CD4+效应细胞与CD4+ IRhigh T细胞以及NKT细胞与NKT IRhigh细胞之间的比较中也观察到类似结果（图S3G和S3H）。CD8+ IRhigh T细胞的耗竭评分显著高于CD8+ Teff，而细胞毒性评分和增殖评分显著较低（图S3I和数据S4）。这些结果表明两组患者的骨髓中均存在Tex细胞。

- 在自身来源和供体来源的Tex细胞中，中等和大型克隆指数克隆型在组2中占据更多基因库空间（图S4A）。在基因表达方面，CD8+ Tex细胞中大多数抑制性受体和效应分子（如GZMB和PRF1）的表达水平在组1中显著高于组2（图3A和S4B）。组1的耗竭和细胞毒性评分较高，而组2的增殖评分较高（图S4C）。组1中耗竭相关转录因子（如TOX和EOMES）的表达水平较高，而组2中NR4A2的表达水平较高（图3A）。尽管患者水平分析未达到统计学显著性，但大多数患者在转录因子表达变化上表现出一致趋势（图S4D），表明单细胞水平观察到的差异可能反映了耗竭相关转录程序的整体变化。这些结果表明，自身来源（组1）和供体来源（组2）Tex细胞群体中富含不同的转录因子相关调控程序。

- 总之，本研究通过单细胞RNA测序和免疫分析技术，系统地研究了AML患者移植前后骨髓中的免疫细胞和类白血病细胞亚群，揭示了免疫抑制性微环境的变化及其与T细胞耗竭的关联，为AML的治疗提供了新的靶点。威尔科克森秩和检验（双侧）。（B）点图显示了通过pySCENIC评估的选定转录因子（TF）基序在HD、SCT前NR和SCT后复发样本类型中的激活情况。（C）热图显示了选定TF基序在HD、SCT前NR和SCT后复发样本类型中的标准化平均表达量。（D）CD8+ Tex中SCT前NR样本类型的转录因子NFATC1的基因调控网络。（E）CD8+ Tex中SCT后复发样本类型的转录因子NFATC2的基因调控网络。（F）根据CD8+ Tex亚型对所有4,913个CD8+ Tex细胞进行UMAP绘图。（G）热图显示了不同CD8+ Tex亚型的选定标记基因的标准化平均表达量。（H）HD、SCT前NR和SCT后复发样本类型中不同CD8+ Tex亚型的比例。（I）热图显示了按不同样本类型划分的不同CD8+ Tex亚型的选定标记基因的标准化平均表达量。（J）点图显示了通过pySCENIC评估的选定TF基序在按不同样本类型划分的不同CD8+ Tex亚型中的激活情况。（K）热图显示了按不同样本类型划分的不同CD8+ Tex亚型的选定TF基序的标准化平均表达量。对于点图（B和J），颜色代表选定TF基序的曲线下面积（AUC），点大小代表在指定簇中选定TF基序的百分比活性。对于基因调控网络图（D和E），箭头的方向代表基因调控的方向，线条的粗细代表调控的强度。

在慢性感染和癌症中，CD8+ T细胞中IR的持续表达会破坏c-Jun/AP-1的激活，导致无伴侣的NFAT，从而触发与耗竭相关的基因表达。NFAT家族成员，包括NFATC1、NFATC2和NFATC3，在T细胞的发育和功能中起着重要作用。尽管我们的分析中识别出了多个与TF相关的程序，但由于NFAT信号传导在T细胞耗竭中的已知作用，我们主要关注了NFAT家族成员。在CD8+ Tex中，NFATC1和NFATC3在组1中高度活跃和表达，而NFATC2在组2中高度活跃和表达（图3B和3C）。通过调控子特异性得分（RSS）评估和排名的调控子也表明，NFATC1和NFATC3位于组1中排名前100的TF中，而NFATC2位于组2中排名前100的TF中（图S4E和S4F）。此外，在CD8+ Tex中，NFAT家族，尤其是NFATC1，主要调节组1中TOX、EOMES和多个IR的表达；然而，在组2中，NFAT家族，主要是NFATC2，主要调节NR4A2和多种IR的表达（图3D、3E和S4G）。另外，在组1中的CD8+ Tex中，TOX和EOMES强烈调节IR的表达；然而，在组2中，NR4A2主要调节IR和效应相关分子的表达（图S4H）。综合这些发现，自体来源的CD8+ Tex特征是NFATC1相关转录程序富集，同时TOX和EOMES表达增加，而供体来源的CD8+ Tex则表现为NFATC2相关特征的富集，并伴有NR4A2表达升高。

我们识别出了四个主要的CD8+ Tex亚群，包括一个祖细胞群（Texprog）、一个效应细胞群（Texeff）、一个更加耗竭的细胞群（Texterm）和一个活跃分裂的细胞群（图3F和3G）。在HDs、组1和组2之间，CD8+ Tex亚群的比例没有显著差异（图3H和S5A）。Slingshot轨迹推断分析揭示了从Texprog向其他三种Tex亚型的转变（图S5B）。TCR库分析显示，小克隆指数克隆型在Texeff和Texterm亚型中占据了更多的库空间，而中等克隆指数克隆型在Texprog和增殖性Tex亚型中占据了更多的库空间（图S5C）。我们发现Texterm亚群的耗竭得分最高，Texeff亚群的细胞毒性得分最高，增殖性Tex亚群的增殖得分最高（图S5D）。接下来，我们观察到在Texprog、Texeff和Texterm亚群中高度活跃的TF分别是NFATC3、NFATC2和NFATC1（图S5E）。基因调控网络分析显示，在Texprog细胞中，NFATC3主要调节HAVCR2、EOMES和TCF7的表达。在Texeff细胞中，NFATC2主要调节效应相关基因如TBX21、ZEB2和GZMB的表达；而在Texterm细胞中，NFATC1主要调节与终末耗竭相关的基因如TOX、EOMES、CTLA4和HAVCR2的表达（图S5F–S5H）。此外，我们发现每个Tex亚型在组1中的TOX和EOMES表达水平较高，但在组2中的NR4A2表达水平较高（图3I）。TF活性分析表明，在组1中，NFATC3在Texprog和Texeff亚群中高度活跃和表达，而在组2中，NFATC1和NFATC3在Texterm亚群中高度活跃和表达（图3J和3K）。总体而言，这些结果表明Texprog亚群可以通过不同TF的激活分化为其他Tex亚群，这些亚群的耗竭程度、细胞毒性潜力和增殖能力各不相同。

在AML患者移植前后，骨髓中的免疫抑制性微环境对骨髓细胞进行基于图的亚群划分，揭示了五个簇，包括GMPs、单核细胞、DCs、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞（图4A和4B）。在HDs、组1和组2之间，主要骨髓细胞亚群的比例没有显著差异（图4C和S6A）。

图4 AML患者骨髓中的骨髓细胞景观和免疫抑制微环境
(A) 根据骨髓亚型对所有14,709个骨髓细胞进行UMAP绘图。
(B) 点图显示了不同骨髓细胞亚型中选定标记基因的标准化平均表达量。颜色代表平均表达水平，点大小代表在指定簇中选定标记基因的百分比表达。
(C) HD、SCT前NR和SCT后复发样本类型中不同骨髓细胞亚型的比例。
(D) 热图显示了HD、SCT前NR和SCT后复发样本类型中与不同功能相关的选定特征基因的标准化平均表达量。
(E) 热图显示了HD、SCT前NR和SCT后复发样本类型中与不同功能相关的选定特征基因的标准化平均表达量。
(F) 热图显示了HD样本类型、SCT前NR和SCT后复发样本类型中与不同功能相关的选定特征基因的标准化平均表达量。

单核细胞分析显示，与HDs中的单核细胞相比，CD274和白细胞介素（IL）-10在组1和2中表达较高，而ICOS配体ICOSLG在组1和2中表达较低（图4D）。与HDs中的单核细胞相比，MYC、STAT1和NFKB1在组1中高度活跃和表达，而只有STAT1和NFKB1在组2中高度活跃和表达（图4D和S6B）。在人类肝细胞癌外周单核细胞中，PD-L1的表达与JAK2/STAT1和JAK2/STAT3/c-MYC的激活有关。此外，直接干预如NF-κB等TF可能是逆转AML患者肿瘤微环境中免疫抑制性骨髓成分活性的有希望策略。我们对单核细胞中MYC、STAT1和NFKB1的基因调控网络分析表明，这些基因可以调节IR配体、免疫抑制性细胞因子以及单核细胞与Tex之间相互作用的配体的表达（图S6C）。

我们发现，与HDs中的单核细胞相比，组1和2中的DCs表达了高水平的CD274、PDCD1LG2、IL-10和HLA-E，但HLA-II类分子如HLA-DRA、HLA-DRB1和HLA-DQA1的表达水平较低（图4E）。与HDs中的DCs相比，组1和2中的STAT1和NFKB1均高度活跃和表达（图4E和S6D）。先前的研究表明，DC内在的IFN-γ-JAK1-STAT1信号传导可以诱导PD-L1的表达，这是DC将CD4+ T细胞转化为Tregs所必需的。此外，DC内在的NF-κB1的表达决定了DC指导Th2细胞分化的能力。我们的结果表明，这两种TF（STAT1和NFKB1）可以调节IR配体、DC的抑制性细胞因子以及DC与Tex之间相互作用的配体的表达（图S6E）。

在骨髓微环境中，Tregs通过表达Foxp3（通过NF-κB通路等）和特定分子如PD-1和CTLA-4发挥调节功能。此外，Tregs通过CD25（IL-2Rα）与IL-2强结合，从而通过CD25/STAT5信号通路增强Treg的免疫耐受性。先前的研究表明，肿瘤内浸润的Tregs会促进肿瘤内T细胞的耗竭状态，而肿瘤微环境中浸润Tregs的丢失会增强抗肿瘤CD8+ T细胞的效应反应并防止T细胞的功能耗竭。我们的Tregs研究结果表明，与HDs中的Tregs相比，组1和2中的IRs如PDCD1、CTLA4、LAG3、HAVCR2、TIGIT、抑制性细胞因子（TGFB1）、格兰zin酶B和穿孔素（这两种分子可以触发CD8+ T细胞和NK细胞的凋亡）、IL2Rα、关键TFs如FOXP3、STAT5和NFKB1以及LCK和HLA I类分子（这些分子参与Tregs与Tex之间的相互作用）的表达水平较高；其中大多数分子在组2中表达得更明显（图4F）。此外，与HD中的造血干细胞和祖细胞相比，HSC样 blast中的CD274、CD48、FGL1、IL-10、CD47以及与Tex相互作用的配体如TGFB1、LGALS9和HLA I类分子的表达水平更高，而HSC样 blast中的共刺激分子配体TNFSF4的表达水平较低（图4G）。

总之，这些发现表明，在R/R AML患者移植前后的骨髓中，单核细胞、DCs、Tregs和HSC样blast具有免疫抑制效应，并构成了一个免疫抑制性的骨髓微环境。白血病样细胞介导的细胞间相互作用在移植前后诱导CD8+ T细胞的耗竭。我们发现在组1和2中，白血病样细胞可以直接与CD8+ Teff和CD8+ Tex相互作用，并在所有T细胞亚型中表现出最强的相互作用强度（图5A和5B）。在组1中，CellChat和scMLnet分析都显示，如HLA-E:CD8A/B、MIF:(CD74+CD44)、LGALS9:PTPRC和TGFB1:TGFBR1/2等配体-受体对在白血病样细胞与CD8+ Tex之间的相互作用中较为丰富（图5C）。ScMLnet分析还预测，这些配体-受体对可能进一步调节NFAT家族TF的激活，这与触发CD8+ Teff的耗竭有关（图5D）。在组2中的类似分析得到了相似的结果，只是未检测到TGFB1:TGFBR1/2配体-受体对（图5E和5F）。我们之前的研究结果表明CD8+ Tex可能有从CD8+ Teff转变的潜力，这促使我们进一步分析了白血病样细胞与CD8+ Teff之间的相互作用。CellChat和scMLnet分析预测，白血病样细胞通过与相应样本类型的CD8+ Tex之间的相同通路与CD8+ Teff相互作用，从而调节CD8+ Teff中NFAT家族TF的表达（图5C、5E、S7A和S7B）。这些结果表明，类白血病细胞可能通过配体（如MIF、LGALS9和HLA I类分子）参与自身来源和供体来源的CD8+ Tex细胞的耗竭相关转录程序。图5显示了不同疾病阶段AML患者中类白血病细胞与T细胞之间相互作用的比较。

这些结果表明，类白血病细胞可能通过配体（如MIF、LGALS9和HLA I类分子）参与自身来源和供体来源的CD8+ Tex细胞的耗竭相关转录程序。图5显示了不同疾病阶段AML患者中类白血病细胞与T细胞之间相互作用的比较。

在两组患者中，我们观察到类白血病细胞都可以与CD8+ Tex细胞相互作用：首先，类白血病细胞可以直接与CD8+ Tex细胞相互作用；其次，类白血病细胞可以通过多种配体-受体对与T调节细胞（Tregs）、单核细胞（monocytes）和树突状细胞（DCs）相互作用，而这些免疫细胞又会与CD8+ Tex细胞发生相互作用。具体来说，在组1中，scMLnet分析预测类白血病细胞可能影响Tregs中免疫抑制性转录因子（TF）相关程序的活性，包括NFKB1A和STAT5A，这些转录因子通过多种配体-受体对（如MIF:CD74+CD44和LGALS9:PTPRC）与LCK的表达相关（见图S7E和S7F）。Tregs与CD8+ Tex之间的信号传递进一步与CD8+ Tex中的NFAT家族相关转录程序相关（见图S7G和S7H）。同样，在组1中，类白血病细胞也被预测可以调节单核细胞中免疫抑制性转录因子相关程序的活性，如MYC、NFKB1和STAT1，这些转录因子通过多种配体-受体对（如MIF:CD74+CD44、LGALS9:PTPRC和TGFB1:TGFBR1/2）与CD86、TNFSF13和GRN的表达相关（见图S8A和S8B）。CD86、TNFSF13和GRN还被预测参与与CD8+ Tex中NFAT家族相关转录活性相关的信号传递（见图S8C和S8D）。此外，在组1中，类白血病细胞与DCs之间的相互作用涉及多种配体-受体对（如MIF:CD74+CD44、LGALS9:PTPRC和TGFB1:TGFBR1/2），这些相互作用与DCs中NFKB1和STAT1相关的转录程序以及CD86和GRN的表达相关（见图S8E和S8F）。CD86和GRN还被预测参与与CD8+ Tex中NFAT相关转录程序相关的DC-CD8+ Tex通信途径（见图S8G和S8H）。组2中也观察到了类似的相互作用模式，类白血病细胞通过MIF、LGALS9和TGFB1相关的信号通路调节Tregs、单核细胞和DCs的相应转录因子相关程序及其下游目标基因的表达。这些目标基因又可能与CD8+ Tex中的NFAT家族相关转录活性相关（见图S9和S10）。

生存分析使用GEPIA2的癌症基因组图谱（TCGA）数据，针对移植前后诱导CD8+ Tex的十一个主要配体进行了研究。我们根据每个配体的中位表达水平将AML患者分为两组，并观察到只有TGFB1的表达与生存预后相关（见图5G）。接下来，我们将这些配体合并成基因集进行生存分析，发现仅包含与类白血病细胞相关的配体的基因集对生存具有预后意义，并且比单独考虑TGFB1时效果更好（见图5H和5I）。此外，无论HLA I类分子如何，仅包含三个配体（MIF、LGALS9和TGFB1）的基因集对AML患者的预后价值最高（见图5J）。总之，我们的发现表明，高表达MIF、LGALS9和TGFB1基因集的AML患者预后较差。

我们进一步使用CellChat分析了不同亚型类白血病细胞在移植前后与其他类型免疫细胞之间的相互作用。在组1中，与其他类型的类白血病细胞相比，前体样、GMP样、DC样和HSC样类白血病细胞与CD8+ Teff、CD8+ Tex、Tregs、单核细胞和DCs的相互作用更强（见图6A和6B）。基于整个类白血病细胞与其他类型免疫细胞之间的相互作用，HSC样母细胞样细胞与CD8+ Tex、Tregs和DCs的相互作用配体-受体对最为全面，且其相互作用概率相对较高（见图6C和6D）。组2的分析也得到了类似的结果，进一步突出了HSC样或前体样类白血病细胞与其他类型免疫细胞之间的相互作用强度（见图6E–6H）。这些结果表明，HSC样类白血病细胞在移植前后的类白血病细胞与其他类型免疫细胞之间的相互作用中起着更关键的作用。

总之，类白血病细胞被预测可以通过直接途径（主要涉及MIF、LGALS9和HLA I类分子等配体）和间接途径（主要涉及MIF、LGALS9和TGFB1等配体）与自身来源的CD8+ T细胞相互作用，这导致CD8+ Tex中NFATC1和NFATC3相关转录程序的活性增强以及TOX和EOMES的表达升高（见图7A和数据S5）。同样，类白血病细胞也被预测可以通过类似的配体-受体通路与供体来源的CD8+ T细胞相互作用，这与供体来源CD8+ Tex中NFATC2相关调控特征的富集和NR4A2表达的增加有关（见图7B和数据S6）。在所有类白血病细胞亚型中，HSC样细胞在与其他类型免疫细胞（CD8+ Tex、Tregs、单核细胞和DCs）的相互作用中最为突出。

在这个研究中，我们比较了移植前后的AML患者中免疫抑制性骨髓微环境（BM）中的CD8+ Tex细胞。我们发现自身来源的CD8+ Tex细胞其特征是NFATC1/NFATC3相关转录程序的富集以及TOX和EOMES表达的增加，而供体来源的CD8+ Tex细胞则表现出NFATC2相关特征的富集和NR4A2表达的增加。AML细胞通过涉及MIF、LGALS9和TGFB1的类似信号通路与这两种类型的CD8+ Tex细胞相互作用。我们的工作提供了关于自身来源和供体来源CD8+ Tex细胞不同转录程序的比较特征，并指出了未来研究中调节T细胞耗竭的潜在靶点。现有数据表明，长期的抗原暴露通过TFs（如TOX、NR4A和EOMES）诱导T细胞耗竭。在AML中，自身来源的CD8+ Tex细胞的特征是NFATC1/NFTC3-TOX/EOMES相关转录程序的富集，而供体来源的CD8+ Tex细胞则表现出不同的NFATC2-NR4A2相关调控特征。研究表明，TOX或NR4A的缺失能够增强细胞因子的产生并减少T细胞中的免疫抑制（IRs）。此外，PD-1/PD-L1阻断主要通过胞质信号传导发挥作用，而不是重塑CD8+ T细胞中与转录因子（TFs）相关的染色质可及性。总的来说，他人和我们报告的这些发现可能有助于理解急性髓系白血病（AML）患者对免疫检查点抑制剂（ICIs）反应不佳的原因，并提示针对自我来源的CD8+ T细胞中的TOX以及供体来源的CD8+ T细胞中的NR4A2可能是逆转T细胞耗竭的潜在策略。在这项研究中，我们发现白血病细胞通过单核细胞、树突状细胞（DCs）和调节性T细胞（Tregs）直接或间接与自身和供体来源的CD8+ T细胞相互作用，主要通过MIF、LGALS9和TGFB1介导。值得注意的是，在移植后，白血病细胞与供体来源的CD8+ T细胞之间不存在直接的TGF-β1介导的相互作用。先前的研究也已经证明了MIF、LGALS9和TGFB1在诱导T细胞耗竭中的作用。在弥漫性大B细胞淋巴瘤中，巨噬细胞与T细胞之间的相互作用（通过LGALS9:HAVCR2、CD86:CTLA4和NECTIN2:TIGIT介导）在疾病进展过程中增强。在黑色素瘤模型中，肿瘤中MIF表达的增加导致CD74+巨噬细胞的募集，从而引发明显的T细胞耗竭表型，进而减弱抗肿瘤免疫力；此外，在小鼠中敲除Mif的肿瘤细胞减少了T细胞耗竭并增强了细胞毒性T细胞的功能。另外，肝细胞癌细胞促使肝星形细胞分泌TGF-β1，从而促进CD4+ T细胞的耗竭和调节性T细胞的分化。值得注意的是，TGF-β信号在T细胞耗竭中的作用可能比单纯的免疫抑制作用更为复杂，且取决于具体背景。先前的研究表明，TGF-β信号不仅参与耗竭相关过程，还参与维持干细胞样前体T细胞的状态。因此，尽管我们的数据在AML中识别出了与TGF-β1相关的信号相互作用，但TGF-β信号对自身和供体来源的CD8+ T细胞群体的确切功能影响仍需进一步研究。总体而言，我们的发现表明，与MIF、LGALS9和TGF-β1相关的信号通路可能促进AML中CD8+ T细胞的耗竭状态，然而具体的配体-受体对因疾病背景而异。这种超出传统免疫检查点（如PD-1/PD-L1）的功能性相互作用的多样性可能有助于解释目前可用ICIs在AML中疗效有限的原因，并可能将MIF、LGALS9和TGF-β1视为潜在的治疗靶点。

利用Cheng等人开发的scMLnet工具包，我们能够将配体-受体相互作用与其在CD8+ T细胞中的下游转录因子（TFs）联系起来。我们发现，在直接通路中，AML细胞被认为通过涉及MIF、LGALS9和HLA I类分子的配体与CD8+ T细胞相互作用，这些配体与CD8+ T细胞中的NFAT家族相关转录程序有关。在间接通路中，包括调节性T细胞、单核细胞和DCs在内的中间免疫细胞群体被认为通过LCK和CD86等配体与CD8+ T细胞进行通信，从而可能促进CD8+ T细胞中的耗竭相关转录状态。正如先前的研究所描述的，CD8+ T细胞的耗竭是由TCR信号驱动的，进而激活NFAT-TCF1通路，随后激活TOX/NR4A轴。

总之，我们描述了AML免疫环境的两种不同情况，包括细胞组成和表型、T细胞功能、转录调控谱以及细胞间相互作用。我们的结果表明，NFAT、TOX、EOMES和NR4A2相关转录程序的活性有助于区分自身来源和供体来源的CD8+ T细胞，并有助于针对耗竭进行有针对性的干预。此外，靶向关键的细胞间相互作用分子（例如MIF、半乳糖凝集素-9、TGF-β1和NR4A2）可能是逆转T细胞耗竭的策略。

本研究的几个局限性包括：首先，这些发现主要是通过计算得出的，这些识别出的调节因子（例如TFs和配体）在AML中T细胞耗竭中的功能作用需要进一步的实验验证；其次，扩大样本规模将提高统计功效并降低观察到变量之间虚假关联的可能性，尤其是对于相对罕见的细胞类型。更大的样本队列还将允许更好地平衡不同AML亚型并在患者中进行风险分层，从而增强我们结果的普遍性。

**资源可用性**
如需进一步的信息、资源和试剂，请联系首席联系人Ying-Jun Chang（[e-mail]）。

**数据与代码可用性**
- 本研究中生成的scRNA-seq和scTCR-seq数据已存档于中国国家生物信息中心（CNCB）的国家基因组数据中心（NGDC）的基因组序列档案（GSA），访问号为HRA016119。
- 本文未报告原创代码。
- 如需重新分析本文中的数据，请向首席联系人咨询。

**致谢**
本研究得到了国家自然科学基金（82293630、82293633和62273364）和北京市科学技术委员会（Z221100007422008）的资助。我们感谢American Journal Experts（www.aje.com）在编辑本手稿方面提供的帮助。图形摘要、图1A和图7是用BioRender.com创建的。

**作者贡献**
Y.-J.C.和X.-J.H.设计了这项研究。Y.-J.C.、C.-Z.Y.、H.C.、Y.-H.C.、F.-R.W.、Y.-F.C.、Y.-Q.S.、Y.-Y.Z.和M.L.收集数据并进行了单细胞测序。C.-Z.Y.和Y.-L.C.进行了数据分析。X.-H.Z.、L.-P.X.、X.-D.M.、K.-Y.L.、X.-Q.S.和X.-Y.Z.监督了数据分析。Y.-J.C.、Y.W.和X.-S.Z.起草了手稿。所有作者都对数据解释、手稿准备和最终版本的批准做出了贡献。

**利益声明**
作者声明没有竞争利益。

**STAR★方法**
**关键资源表**
**试剂或资源**
**来源**
**标识符**
- 生物样本：AML患者和健康供体的骨髓样本（来自北京大学人民医院）

**关键商业试剂**
- Ficoll溶液（TBDCat #LTS1077）
- Chromium SingleCell 5′ Library和Gel Bead Kit（10× GenomicsCat #PN-1000263）

**存档数据**
- 单细胞RNA测序的数据文件（原始数据）：https://ngdc.cncb.ac.cn/search/specific?db=hra&q=HRA016119
- 单细胞TCR测序的数据文件（原始数据）：https://ngdc.cncb.ac.cn/search/specific?db=hra&q=HRA016119

**软件和算法**
- Cell Ranger（v7.1.0）：https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/R (v4.3.0)
- CRAN：https://www.r-project.org/
- Seurat（v4.3.0）：https://satijalab.org/seurat/harmony (v1.0.2)
- Korsunsky等人：https://github.com/immunogenomics/harmony
- SingleR：https://github.com/SingleR-inc/SingleR
- copykat（v1.1.0）：https://github.com/navinlabcode/copykat
- CytoTRACE（v0.3）：https://github.com/gunsagargulati/CytoTRACE
- clusterProfiler（v4.8.1）：https://github.com/YuLab-SMU/clusterProfiler
- monocle3（v1.3.1）：https://github.com/cole-trapnell-lab/monocle3
- Slingshot（SCP v0.4.8）：https://github.com/zhanghao-njmu/SCP
- SCENIC（v0.12.1）：https://github.com/aertslab/pySCENIC
- iGraph（v1.4.2）：https://github.com/igraph/igraph
- CellChat（v1.6.1）：https://github.com/igraph/
- Jin（v1.6.1）：https://github.com/sqjin/CellChats
- scMLnet（v3.0）：https://github.com/SunXQlab/scMLnet
- Borcherding（v0.1.0）：https://github.com/BorchLab/scRepertoire
- Startrac：https://github.com/Japrin/STARTRAC

**实验模型和研究参与者细节**
- 单细胞RNA-seq和scTCR-seq研究使用了来自北京大学人民医院的十二份骨髓样本（包括四名AML患者的预SCTNR和SCT后复发样本，共两名男性和两名女性，中位年龄为45.5岁（范围25–58岁），以及四名健康供体（HDs）的样本，共两名男性和两名女性，中位年龄为34.5岁（范围32–43岁）。四名AML患者的临床特征总结在图S1A和数据S1中。所有参与的患者和HDs均提供了书面知情同意。本研究遵循赫尔辛基宣言，并获得了北京大学伦理委员会的批准（批准号2023PHB132-001）。

**方法细节**
- 单细胞悬浮液的制备：根据制造商的说明，使用Ficoll溶液（TBD）和密度梯度离心法从AML患者和HDs的髂嵴穿刺液中分离骨髓单核细胞（BMMCs）。简单来说，4毫升新鲜的骨髓血液被收集在EDTA抗凝管中，随后分层到Ficoll上。离心后，残留在血浆-Ficoll界面上的BMMCs小心转移到新管中，并用DPBS清洗两次，然后送进一步处理。
- 文库制备和测序：根据制造商的说明，使用Chromium SingleCell 5′ Library和Gel Bead Kit制备单细胞RNA-seq和TCR-seq文库。简单来说，将单细胞悬浮液调整至700–1200个细胞/μL的浓度（存活率≥85%），使用Countess II自动细胞计数器（Thermo Fisher Scientific，USA）测定。在目标细胞回收过程中，细胞被捕获在液滴中。逆转录步骤后，乳液被打破，产生的条形码cDNA随后用Dynabeads纯化，然后通过聚合酶链反应（PCR）扩增。扩增的cDNA用于5′基因表达文库构建和TCR富集。对于基因表达文库构建，50 ng的扩增cDNA被片段化并末端修复，用SPRIselect珠子选择后，在NovaSeq平台上进行测序，生成150 bp的双端读长。对于TCR文库构建，使用试剂盒提供的DNA引物进行10个循环的PCR扩增。VDJ区域富集的文库用SPRI珠子筛选大小，并在Illumina NovaSeq 6000仪器上进行测序，生成150 bp的双端读长。

**数据预处理和质量控制**
原始读长使用Cell Ranger v7.1.0进行分析，并与GRCh38人类参考基因组序列对齐。使用Cell Ranger软件包的“count”和“vdj”子命令 quantified基因表达和TCR谱型，参数为默认设置。上述过程产生了原始的唯一分子标识符（UMI）计数矩阵，获得了十二份10X衍生数据（包括四名AML患者的pre-SCT NR和SCT后复发样本以及四名HDs的样本）。随后，Cell Ranger生成的基因-细胞矩阵被转换为Seurat对象（Seurat v4.3.0），除非另有说明，否则后续分析在R v4.3.0中进行。所有Seurat对象随后被合并并过滤，排除UMI编号<500、表达基因<250或超过10%的读长映射到线粒体基因的细胞。此外，还过滤掉了检测到超过5000个基因的单个细胞。最后，保留了95,426个细胞用于后续分析。

**scRNA-seq聚类和细胞类型注释**
质量控制后，使用NormalizeData函数对UMI计数进行对数标准化，并使用FindVariableFeatures函数计算具有高细胞间变异的前2,000个特征。然后，使用ScaleData函数对数据集中的特征进行缩放和居中，使用RunPCA函数（默认参数）进行降维。使用R包harmony（版本1.0.2）进行批量校正，以避免样本间的批量效应。随后，使用RunUMAP函数进行非线性降维，使用FindNeighbors和FindClusters函数进行数据聚类分析。

**聚类分析**
所有细胞通过UMAP投影到二维空间后，除了疑似白血病样细胞外，正常的造血细胞根据共同特征被聚类在一起。然而，由于白血病样细胞和正常骨髓细胞之间的基因表达谱交叉，白血病样细胞的特征在不同个体间存在差异，白血病样细胞没有聚集在一起，而是与正常的髓系细胞、红细胞和T细胞混合。因此，对每个AML患者的每个样本与四名HDs独立进行了初步分析，以区分白血病样细胞和它们的正常造血细胞对应物。细胞类型注释和白血病样细胞推断采用了综合策略，而不是依赖单一方法。具体来说，我们考虑了以下特征：（i）簇内的样本来源分布，其中疑似白血病样簇主要由AML患者样本的细胞组成，HD样本的细胞代表性较低；（ii）使用SingleR和NovershternHematopoieticData数据集进行基于参考的注释，显示疑似白血病样细胞经常表现出HSC/前体样的转录特征；（iii）使用R包copykat（版本1.1.0）进行单细胞拷贝数变异（CNV）分析，以供体来源的细胞作为参考，根据非整倍体肿瘤的拷贝数核型区分疑似恶性和非恶性群体；（iv）表达已建立的细胞类型相关标记基因；（v）使用R包CytoTRACE（版本0.3）进行分化状态预测，作为补充分析，而不是作为白血病身份的确切证据，其中白血病样细胞的分化程度低于正常细胞。基于这些分析的综合结果，细胞被分类为七种主要细胞类型。图S1C–S1I展示了使用患者01的预SCT NR样本和四名HDs的注释工作流程示例。然后，我们将所有样本的细胞类型注释结果合并。随后将三种主要细胞类型（即白血病样细胞、T细胞和髓系细胞）进行子集划分，并进一步聚类以检测每种细胞类型内的异质性。

**差异基因表达和功能富集**
使用Seurat（版本4.3.0）的“FindMarkers”函数和Wilcox方法识别白血病样亚组的差异表达基因（DEGs）。基因的|logFC|值大于0.25且调整后的p值小于0.05的被认为是差异表达基因（DEGs），并列在补充数据3中。使用R软件包clusterProfiler（版本4.8.1）和默认参数对这些DEGs进行了GO富集分析。

根据不同细胞群的转录特征和谱系结构，选择了不同的轨迹推断方法。对于类白血病细胞，使用R软件包monocle3（版本1.3.1）进行了伪时间轨迹分析，以重建跨异质状态的发育样轨迹。根节点由CD34、HOPX和FAM30A的平均表达水平确定，这些基因最近被鉴定为类HSC白血病细胞的标记基因。

为了研究CD8+ Tex细胞亚型的轨迹，使用R软件包SCP（版本0.4.8）中的“RunSlingshot”功能提供的Slingshot方法对这组细胞进行了伪时间分析，以推断相对离散的功能状态和耗竭相关状态之间的转换。组变量设置为CD8+ Tex的亚型，而Texprog亚型根据先前的研究被设置为起点。

基因组表达分数的计算使用了Seurat软件包提供的“AddModuleScore”函数，并采用默认参数。包括耗竭、细胞毒性和增殖在内的基因组表达分数的计算结果显示在补充数据4中。

为了基于转录因子（TFs）或它们的目标基因来衡量细胞簇或样本类型之间的差异，对指定的细胞进行了SCENIC分析。在这项研究中，使用了Python（版本3.7.16）中的pySCENIC软件包（版本0.12.1）来评估转录因子的富集和调控子网络的活性。SCENIC工作流程包括三个步骤：（i）识别TF和潜在目标基因之间的共表达模块，然后使用R软件包iGraph（版本1.4.2）中的“graph_from_data_frame”函数可视化基因调控网络，并选择感兴趣的目标基因进行显示；（ii）针对相应TF的基序显著富集的潜在目标推断直接目标基因；（iii）使用恢复曲线下的面积计算每个单细胞的调控子网络活性分数。除了直接比较不同细胞簇或样本类型中特定调控子网络的活性外，我们还采用了基于熵的策略来生成特定于调控子的分数（RSS），以进一步量化调控子的细胞类型特异性或样本类型特异性。人类基因的基序排名来源于网站https://resources.aertslab.org/cistarget/。

为了评估细胞间的通信，我们首先使用了CellChat软件包（版本1.6.1），该软件包包含一个全面的细胞间信号相互作用数据库，用于识别细胞间的潜在配体-受体相互作用。通过CellChat推断细胞间通信包括识别差异表达的信号基因、计算细胞间通信的概率以及发现统计上显著的细胞间通信。我们分别使用CellChat分析了AML患者移植前（pre-SCT）和移植后（post-SCT）复发的样本。

为了分析潜在配体-受体对的下游转录因子和目标基因，我们进一步使用了scMLnet软件包（版本3.0）（https://github.com/SunXQlab/scMLnet3.0/），并更新了先验知识数据库，通过整合细胞间通路（配体-受体相互作用）和细胞内子网络（受体-TF通路以及TF-目标基因调控）来构建多层网络。在本研究中，类白血病细胞、Tregs、单核细胞和DCs被用作主要发送细胞，而CD8+效应T细胞、CD8+ Tex、Tregs、单核细胞和DCs被用作主要接收细胞。对于细胞间相互作用，显示的配体来自于CellChat和scMLnet分析的交集。在CD8+ T细胞中，我们重点关注NFAT家族转录因子（NFATC1、NFATC2和NFATC3）的调控。

为了测试不同识别的配体组合是否能够根据总体生存情况对AML患者进行分层，我们使用了癌症基因组图谱（TCGA）中的AML RNA测序数据集。我们使用基因表达评估交互式分析2（GEPIA2，http://gepia2.cancer-pku.cn/）进行了生存分析。根据签名基因的中位表达值，将AML患者分为高表达组 and 低表达组。随后使用Kaplan–Meier分析来评估表达亚组与总体生存结果之间的相关性。

TCR克隆型分析是基于TCR-seq文库使用R软件包scRepertoire（版本1.10.1）进行的。每个独特的TRA(s)-TRB(s)对在TCR中被定义为一个克隆型。如果一个克隆型存在于至少两个细胞中，则认为这些细胞是克隆性的。基于共享的细胞条形码，将T细胞克隆型数据与T细胞表型数据进行了整合。首先使用clonalHomeostasis函数识别并可视化了特定比例的克隆型所占据的克隆稳态。此外，我们应用了clonalOverlay函数来可视化不同样本类型的克隆扩增情况。接下来，根据clonalOverlap函数计算并可视化了T细胞亚型之间的克隆型重叠情况。我们还使用alluvialClonotypes函数探讨了不同样本类型、T细胞亚型和克隆型之间的动态关系。

为了研究T细胞亚型之间的转换，我们首先使用getCirclize函数确定了它们之间共享的克隆型数量。随后使用R软件包Startrac（版本0.1.0）进行了分析，以评估在进行TCR跟踪时T细胞亚型的细胞命运状态转换，这是通过“pIndex.tran”指数来确定的。

本文中的量化和统计分析使用了R软件（版本4.3.0）进行的。Wilcoxon秩和检验用于比较基因表达水平、基因组表达分数、LSC17分数以及不同样本类型中的细胞簇比例。p值小于0.05被认为具有统计意义。

**补充信息（7）：**
- 下载所有文件：PDF（91.84 MB）
- 文档S1：图S1–S10
- 电子表格S1：单细胞RNA数据集的测序深度和数据质量总结
- 文件S1（953.87 KB）
- 数据S2：类白血病细胞簇中的差异表达基因
- 文件S2（40.49 KB）
- 数据S3：非HSC样祖细胞与HSC样祖细胞之间的差异表达基因
- 电子表格S3（12.15 KB）
- 数据S4：T细胞耗竭、细胞毒性和增殖的参考基因组
- 电子表格S4（10.07 KB）
- 数据S5：移植前（pre-SCT）NR样本中不同细胞类型间相互作用的推断配体-受体对
- 电子表格S5（10.04 KB）
- 数据S6：移植后（post-SCT）复发样本中不同细胞类型间相互作用的推断配体-受体对