《iScience》：Dual roles of AXIN1 as a β-catenin p-S60-dependent cytokinesis machinery and an ESCRT component
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AXIN1在多种信号通路中充当支架蛋白，包括TGF-β、SAPK/JNK和Wnt信号通路；然而，由于此前尚无关于AXIN1在胞质分裂中功能的报道，研究人员探究了这一联系以确定该支架蛋白是否协调细胞分裂。在此，研究人员证明AXIN1定位于细胞间桥的中心暗区——即
AXIN1在多种信号通路中充当支架蛋白，包括TGF-β、SAPK/JNK和Wnt信号通路；然而，由于此前尚无关于AXIN1在胞质分裂中功能的报道，研究人员探究了这一联系以确定该支架蛋白是否协调细胞分裂。在此，研究人员证明AXIN1定位于细胞间桥的中心暗区——即Flemming体，并在其中形成中体环结构。研究人员还证实，在早期末期细胞中，AXIN1与β-catenin p-S60依赖性的胞质分裂机器协同发挥作用。此外，在晚期末期细胞中，AXIN1通过将自己定位在MKLP1和CEP55之间来调控ESCRT复合物的层级招募。基于这些发现，研究人员提出AXIN1在胞质分裂中具有双重功能：在早期末期促进ECT2的招募，以及在晚期末期促进脱落组分的招募，凸显了该信号支架蛋白在协调细胞分裂中向结构性机器的转化作用。
一、研究背景
AXIN1（轴蛋白1）是一种已知的支架蛋白，在经典Wnt信号通路的β-catenin（β-连环蛋白）降解复合体中发挥核心作用，同时也参与TGF-β（转化生长因子-β）、SAPK/JNK（应激激活蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶）和p53等信号通路。已有研究表明AXIN1定位于中心体和有丝分裂纺锤体，提示其可能参与细胞周期进程调控。然而，此前没有任何研究报道AXIN1在胞质分裂（cytokinesis，细胞分裂的最后阶段）中的功能。胞质分裂是一个高度有序的动态过程，包括分裂沟定位、收缩环内陷、中体形成和最终脱落（abscission）四个阶段，涉及微管骨架重组、RHOA（Ras同源家族成员A）信号通路激活以及ESCRT（运输所需的内体分选复合物）介导的膜切割等多种机制。鉴于AXIN1在多个信号通路中扮演支架角色，研究人员推测它可能在胞质分裂这一复杂过程中也发挥组织协调作用，因此开展了此项研究。
二、研究目的与结论
研究人员旨在探索AXIN1在胞质分裂过程中的定位和功能。研究发现：AXIN1在末期细胞中特异性定位于中体（midbody）的Flemming体区域，并形成环状结构；在早期末期，AXIN1作为β-catenin p-S60（第60位丝氨酸磷酸化的β-catenin）依赖性胞质分裂机器的组成部分，参与招募ECT2（上皮细胞转化序列2蛋白）至中体以激活RHOA信号；在晚期末期，AXIN1作为中体环组分，通过连接MKLP1（有丝分裂驱动蛋白样蛋白1）和CEP55（中心体蛋白55）来驱动ESCRT复合物的顺序招募，从而促进脱落过程的完成。这一发现揭示了AXIN1在细胞分裂中的双重功能，拓展了对胞质分裂调控机制的理解，并为因胞质分裂缺陷导致的癌症治疗策略开发提供了潜在靶点。
三、关键技术方法
研究人员使用了以下主要技术方法：
- 1.
免疫荧光共定位分析：利用两种不同的抗AXIN1抗体与多种中体标志物（如PLK1、β-catenin p-S60、ANILLIN、MKLP1、CEP55等）进行共免疫染色，结合超分辨率共聚焦激光扫描显微镜观察AXIN1在HeLa CCL2和MCF-7细胞系中的亚细胞定位。
- 2.
RNA干扰敲低实验：使用两种独立的siRNA（si778和si873）敲低内源性AXIN1，通过免疫印迹验证敲低效率后，检测ECT2定位变化、多核细胞比率以及中体桥表型频率。
- 3.
免疫共沉淀分析：从同步化细胞（胸苷处理S期或诺考达唑处理G2/M期）裂解液中，用抗AXIN1抗体沉淀蛋白质复合物，检测其与β-catenin、PLK1、ANILLIN、ECT2、CEP55和MKLP1的相互作用。
- 4.
活细胞延时成像：共转染pEGFP-C1和pmCherry-Histone H2B质粒，在稳定环境中观察对照和AXIN1敲低细胞的胞质分裂过程，记录延迟、回缩等异常事件。
- 5.
RHOA活化测定：使用Rhotekin-RBD（罗特克林-Rho结合域）珠子捕获活性RHOA，通过免疫印迹评估AXIN1敲低对RHOA活性的影响。
四、研究结果
1. AXIN1定位于末期细胞的中区/中体
通过低浓度去垢剂提取后的免疫荧光染色，研究人员发现AXIN1不仅在前期报道的中心体和有丝分裂纺锤体有分布，还在后期细胞的中区（midzone）和末期细胞的中体（midbody）富集。使用两种不同宿主的抗AXIN1抗体以及膜标志蛋白Na+/K+-ATPase或E-CADHERIN的共染进一步确认了这一新发现的定位。与PLK1的共染显示，在早期末期AXIN1与PLK1共定位于中体，而在晚期末期PLK1主要分布于中体侧翼区，AXIN1则出现在中体之间的暗区。GST-PLK1 PBD（Polo盒结构域）结合实验表明，AXIN1以不依赖磷酸化的方式与PLK1 PBD结合。
2. AXIN1参与β-catenin p-S60依赖性胞质分裂机器
共免疫染色显示，早期末期AXIN1与β-catenin p-S60在中体部分共定位。免疫共沉淀分析表明，在有丝分裂期AXIN1与β-catenin、β-catenin p-S60、PLK1、ANILLIN和ECT2的相互作用显著增强。敲低AXIN1后，ECT2在中体的定位明显缺失，同时RHOA活性显著降低。AXIN1敲低导致多核细胞比率增加约4-8倍，中体桥表型增加约2倍。FACS分析显示>4N细胞增多，KI67染色信号减弱。活细胞成像揭示，92%的对照细胞成功完成分裂，而AXIN1敲低细胞中16%出现胞质分裂延迟，61%发生分裂沟回缩，表明AXIN1缺失严重损害胞质分裂完成。
3. AXIN1是Flemming体的中体环组分
通过与ANILLIN、ECT2、INCENP、Aurora B、KIF4A、PRC1、CHMP4B、ALIX、ACTIN和α-tubulin等多种标志物共染，研究人员确认AXIN1定位于中体的暗区/Flemming体。超分辨率显微镜显示，AXIN1与CEP55或MKLP1形成完全重叠的环状结构。免疫共沉淀分析证实，在后期/末期细胞群中，内源性AXIN1与CEP55和MKLP1形成复合物。
4. AXIN1诱导晚期末期细胞中ESCRT复合物的顺序招募
敲低AXIN1后，CEP55、ALIX、TSG101和CHMP4B在中体的信号强度分别下降约75%、75%、50%和50%，而MKLP1的信号反而有所增强。相反，敲低MKLP1后，AXIN1在中体的定位减少约50%。这些结果表明AXIN1的功能位于MKLP1下游和CEP55上游，构成MKLP1-AXIN1-CEP55-ALIX-TSG101-CHMP4B的脱落信号轴。
五、讨论与结论
讨论部分指出，本研究发现了AXIN1在胞质分裂中的两个新功能，区别于其在经典Wnt信号中的已知作用。在早期末期，AXIN1与β-catenin p-S60依赖性胞质分裂机器协作，将ECT2招募至中体；在晚期末期，AXIN1定位于Flemming体，介导MKLP1与CEP55的相互作用，进而驱动ESCRT组分的顺序招募直至脱落完成。值得注意的是，AXIN1敲低后MKLP1在中体轻微积累而非减少，这可能是由于顺序招募被破坏所致。AXIN1以不依赖磷酸化的方式结合PLK1 PBD的模式与此前报道的β-catenin类似，二者在胞质分裂中的关系有待进一步研究。此外，AXIN1缺失/突变导致的致癌作用既可能与Wnt信号异常有关，也可能源于胞质分裂缺陷引起的基因组不稳定性，两者之间的关联尚需深入探讨。
研究结论：AXIN1在胞质分裂中具有双重功能——在早期末期作为β-catenin p-S60依赖性胞质分裂机器的组分，在晚期末期作为MKLP1-AXIN1-CEP55-ALIX-TSG101-CHMP4B脱落信号轴的组分。AXIN1作为从早期到晚期末期全程参与的胞质分裂因子，其定位在中体中心暗区，而β-catenin和PLK1则位于中体侧翼区域，它们在不同胞质分裂阶段的独特或重叠功能有待阐明。
