携带blaNDM-1的临床耐碳青霉烯类川大肠杆菌全基因组测序及耐药性分析

《Microbiology Spectrum》：Whole-genome sequencing and antibiotic resistance analysis of a clinical carbapenem-resistant Enterobacter chuandaensis

　　

：本研究旨在鉴定一株携带碳青霉烯耐药基因blaNDM-1的罕见临床分离株川大肠杆菌（Enterobacter chuandaensis）。抗菌药物敏感性分析显示，川大肠杆菌EC001对大多数常用抗菌药物耐药，仅对阿米卡星、氯霉素和米诺环素敏感。改良碳青霉烯灭活试验（mCIM）和EDTA改良碳青霉烯灭活试验（eCIM）结果证实，川大肠杆菌EC001产生金属-β-内酰胺酶。川大肠杆菌EC001被鉴定为序列型2493（ST2493），呈现广泛耐药谱。全基因组测序分析表明，该菌株携带两个质粒（p1_EC001和p2_EC001），其中blaNDM-1定位于IncFIB/IncFII型接合质粒p1_EC001上。质粒p1_EC001可转移至大肠杆菌（Escherichia coli），表明其具有种间水平传播潜力。p1_EC001中多数质粒介导的耐药基因位于或邻近多种可移动遗传元件。此外，在blaNDM-1上游检测到一个IS3000元件（3018 bp），而博来霉素耐药相关基因bleMBL位于blaNDM-1下游，其后依次为trpF、dsbD、cutA、groS、groL和ISKpn19。此外，在p1_EC001上鉴定到一个携带intI1-dfrA12-aadA2-qacEdeltal-sul1基因阵列的1型整合子。质粒p2_EC001被鉴定为可移动质粒，检测到两个关键基因mbeA和mbeC，分别编码质粒动员松弛酶MbeA和辅助蛋白MbeC。综上所述，本研究揭示了川大肠杆菌EC001的抗菌药物敏感性、质粒特征及潜在传播机制，为临床川大肠杆菌的控制与预防提供了依据。

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一、研究背景与研究意义

耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌（Carbapenem-resistant Enterobacterales，CRE）是一类获得碳青霉烯耐药性的革兰阴性菌，碳青霉烯类药物是治疗多种严重细菌感染的最后防线抗菌药物。CRE是全球扩展最快的多重耐药菌类群之一，因其相关的高发病率和死亡率，对全球公共卫生和现代临床医疗体系构成重大威胁。世界卫生组织2024年发布的细菌优先病原体清单将CRE列为关键优先级病原体，进一步证实了该类病原群造成的严重公共卫生负担。

CRE的耐药表型可由多种分子机制介导，包括碳青霉烯酶产生、孔蛋白改变、外排泵过表达、青霉素结合蛋白修饰和生物膜形成。碳青霉烯酶作为β-内酰胺酶家族的一个亚类，可水解碳青霉烯类抗生素。根据Ambler分类系统，碳青霉烯酶分为A、B、D三类，其中B类即金属-β-内酰胺酶，依赖锌离子催化β-内酰胺的水解。碳青霉烯酶编码基因通常定位于可移动元件上，通过接合、转化、转导和转座等水平基因转移方式传播，导致耐药菌株广泛流行。

川大肠杆菌（Enterobacter chuandaensis）于2017年首次从中国成都华西医院一名患者的血液标本中分离获得，该物种原始型菌株对多数β-内酰胺类抗生素耐药，但对碳青霉烯类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类保持敏感。2024年，郑州大学第一附属医院报道了首例同时携带bla_NDM-1和两份bla_KPC-2拷贝的多重耐药川大肠杆菌临床病例，表明碳青霉烯酶编码基因已在该新鉴定细菌物种中出现。目前关于川大肠杆菌碳青霉烯耐药性的研究仍相对有限，深入研究耐药基因的传播机制有助于阐明细菌耐药的进化和传播机制，促进多重耐药菌出现的早期预防，有效提高临床感染控制效率，遏制抗菌药物耐药性的扩散。

二、研究内容与主要结论

研究人员对2024年10月从中国西安核工业417医院一名患者痰标本中分离的川大肠杆菌EC001菌株进行了系统研究。该患者经初始经验性抗生素治疗后发热和感染标志物改善，但后续痰培养鉴定出多重耐药川大肠杆菌并出现高热复发，调整治疗方案为米诺环素联合伏立康唑后症状缓解出院。抗菌药物敏感性试验显示，除阿米卡星、氯霉素和米诺环素外，该菌株对所有其他临床常用抗菌药物均耐药，呈现广泛耐药谱。mCIM和eCIM结果分别显示抑菌圈直径为6 mm和20 mm，均为阳性，证实该菌株产生碳青霉烯酶和金属-β-内酰胺酶。全基因组测序分析表明该菌株携带一个4,961,006 bp的环状染色体，平均GC含量为55.5%，平均核苷酸一致性分析确认与川大肠杆菌090028高度相似，多位点序列分型鉴定为ST2493型。系统发育分析显示该菌株与重庆医科大学附属第一医院采集的临床分离株HD8830亲缘关系密切。该菌株携带两个质粒p1_EC001和p2_EC001，其中p1_EC001为IncFIB/IncFII型接合质粒，全长173,813 bp，携带11个耐药基因，包括bla_NDM-1、aadA2、aac(3)-IId、bla_TEM-1、ble_MBL、Mph(A)、mrx、qnrS1、sul1、qacEdeltal和dfrA12。质粒p2_EC001为5,115 bp的可移动质粒，携带mbeA和mbeC基因。接合转移试验证实p1_EC001可从川大肠杆菌EC001转移至大肠杆菌EC600，且转接合子对美罗培南的MIC值升高八倍，验证了该质粒的种间传播能力。

三、主要技术方法

研究人员采用以下关键技术方法开展研究：使用DL-96II半自动化系统对17种抗菌药物进行药敏试验；按照CLSI M100指南进行mCIM和eCIM碳青霉烯酶表型检测；采用Illumina NovaSeq 6000平台进行全基因组测序，使用SPAdes v3.15进行de novo组装；通过JSpeciesWS服务器进行ANI分析确认物种分类；使用Prokka进行基因组注释，ResFinder鉴定耐药基因，ISFinder鉴定插入序列；通过Center for Genomic Epidemiology网站进行MLST分型和复制子分型；使用CSI Phylogeny 1.4基于SNP推断系统发育关系；以大肠杆菌EC600为受体菌进行接合转移试验。样本来源为2024年10月中国西安核工业417医院一名患者的痰标本。

四、研究结果

临床病例概述：川大杆菌EC001分离自西安核工业417医院患者痰标本，患者经抗生素方案调整后康复出院。

抗菌药物敏感性及碳青霉烯酶表型检测：该菌株对除阿米卡星、氯霉素和米诺环素外的所有测试抗菌药物耐药；mCIM和eCIM结果均为阳性，证实产生碳青霉烯酶和金属-β-内酰胺酶。

全基因组测序及耐药基因分析：菌株携带4,961,006 bp环状染色体，ANI分析确认物种为川大肠杆菌，MLST鉴定为ST2493型，系统发育分析显示与HD8830亲缘关系最近。质粒p1_EC001携带11个耐药基因，涵盖碳青霉烯类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、博来霉素、大环内酯类、氟喹诺酮类、磺胺类、季铵盐类和甲氧苄啶类耐药。

质粒p1_EC001分析：该质粒为IncFIB/IncFII型接合质粒，属于MOB_F家族，携带traI、traD和traA等完整接合转移模块。BLASTN比对显示与肠杆菌L950hy来源的pL950hy-3质粒高度相似。bla_NDM-1上游检测到IS3000元件，下游依次为ble_MBL-trpF-dsbD-cutA-groS-groL-ISKpn19。鉴定到一个携带intI1-dfrA12-aadA2-qacEdeltal-sul1基因阵列的1型整合子。

质粒p2_EC001分析：该质粒为5,115 bp的可移动质粒，属于MOB_P家族，携带mbeA和mbeC基因及MOB_P型oriT序列，但缺乏 mating pair formation 系统基因，需依赖共存的接合质粒提供T4SS通道。

质粒p1_EC001的转移性：接合转移试验证实p1_EC001可转移至大肠杆菌EC600，转接合子对美罗培南耐药性升高八倍，PCR验证bla_NDM-1存在于转接合子中。

五、讨论与结论

讨论部分指出，CRE已在全球范围内被检测到，不同地区流行水平各异。本研究中鉴定的携带bla_NDM-1的多重耐药川大杆菌EC001证实了碳青霉烯酶编码基因在该新物种中的存在，对公共卫生构成重大威胁。系统发育分析显示ST2493是川大杆菌的优势序列型。质粒p1_EC001被鉴定为接合质粒，具备oriT序列、T4SS区域、T4CP和松弛酶等全部核心功能元件；质粒p2_EC001被鉴定为可移动质粒，携带mbeA和mbeC基因但缺乏自我转移所需的结构机制。可移动遗传元件在耐药基因传播中发挥重要作用。针对CRE的防控，新型抗生素开发、耐药管理、国际合作和微生物组干预策略均至关重要。由于及时实施了针对性的隔离和预防措施，该菌株未导致医院内暴发，相关感染得到有效管理和控制。研究结论建议将CRE传播预防方案常规纳入临床实践，并需要多部门加强CRE防控策略以减轻CRE的出现和传播。