整合基因组学与实验验证识别结直肠癌肝转移相关机械敏感六基因特征及SDC1的刚度响应作用

《iScience》：Integrative genomics and experimental validation identify a mechanosensitive gene signature associated with colorectal cancer liver metastasis

　　

机械性肿瘤微环境（mechanical tumor microenvironment）对结直肠癌（colorectal cancer, CRC）的进展和转移具有关键影响，但其潜在分子介质仍未被充分明确。通过整合单细胞转录组学（single-cell transcriptomics）、批量RNA测序（bulk RNA-seq）、加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）和117种机器学习算法，研究人员鉴定出一个与CRC肝转移相关的六基因机械敏感特征（six-gene mechanosensitive signature）（SNX7、SDC1、CDCP1、PTGES、EMP2和CALB2）。该特征在多个独立队列中表现出优于74个已发表CRC特征的预后性能（平均C-index 0.68）。在这些基因中，SDC1在CRC细胞和组织中持续上调，并且在可调水凝胶培养系统中，其表达进一步受到基质刚度增加的诱导。这些发现支持一个具有稳健预后价值的机械敏感基因特征，并将SDC1鉴定为刚度响应性候选调节因子，为CRC转移的机械生物学调控提供了见解。

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）仍是全球癌症相关发病和死亡的主要原因之一。在中国，CRC是第二大常见诊断恶性肿瘤，且受人口老龄化、饮食改变和生活方式变化等因素影响，发病率持续上升。分子上，CRC发病涉及多个关键基因的协同作用：APC突变破坏Wnt信号通路稳态并导致腺瘤性息肉形成；KRAS和BRAF突变通过激活MAPK及MEK/ERK信号通路促进肿瘤细胞增殖和侵袭；TP53突变损害基因组监视机制并加速恶性转化；PIK3CA突变异常激活PI3K通路，增强肿瘤细胞生长和存活。这些遗传改变共同驱动CRC发生发展，并影响治疗反应和患者预后。随着疾病进展，癌细胞可穿透基底膜进入血液和淋巴管，转移至肝、肺等远处器官，严重损害器官功能，并将5年生存率降低至不足20%。转移性CRC的高死亡率凸显阐明其分子机制的紧迫性。更深入理解不仅可能揭示侵袭和转移的内在驱动因素，也可为早期诊断、精准治疗和靶向干预提供理论基础和技术支持，最终改善患者生存和生活质量，并对整体医疗结局产生深远影响。在肿瘤学中，机械刺激已成为关键且不断发展的研究方向，揭示其在实体瘤发生和进展中的多重作用。机械刺激涵盖细胞微环境中的多种物理力，包括基质刚度、剪切应力和压缩力，这些均可深刻影响肿瘤细胞行为。在这些机械线索中，本研究主要关注基质/底物刚度，因为实验验证使用刚度可调水凝胶培养系统。越来越多证据表明，机械刺激激活多种信号通路，显著影响肿瘤细胞增殖、转移和侵袭。在增殖方面，适当机械线索可促进细胞周期进程和加速分裂；在转移和侵袭方面，机械力重塑细胞骨架并增强迁移能力，使肿瘤细胞突破组织屏障并播散至远处部位。机械刺激的促肿瘤作用已在多种实体恶性肿瘤中记录：在乳腺癌中，POSTN-INTEGRIN和YAP等机械转导信号介导基质刚度诱导的侵袭；在胰腺癌中，靶向机械应力是增强奥沙利铂疗效的有前景策略；在肝癌中，机械应力通过SP1-IL4I1-AHR轴促进耐热性。此外，机械刺激还通过不同机制影响肺癌和前列腺癌等肿瘤进展。值得注意的是，结直肠持续承受多种机械线索，包括蠕动和腔内压力；然而，基质刚度是机械微环境中可在实验上操作的部分，可能影响CRC发生发展，尤其是转移。研究机械刺激与CRC的关系不仅可能揭示独特致病机制并为早期检测提供新生物标志物，也可为治疗干预开辟新途径，从而显著改善患者预后，具有科学和临床相关性。基于此，本研究旨在整合机械敏感和肝转移相关基因，利用多种机器学习方法开发和验证新的CRC预后模型。该模型的临床效用通过分析按模型分层的高风险和低风险患者组之间免疫微环境、药物敏感性和免疫治疗反应差异进行系统评估。此外，采用定量逆转录PCR（qRT-PCR）、western blot和免疫组织化学（IHC）检测六个模型基因在正常结直肠上皮细胞与CRC细胞系中的表达。利用可调底物刚度培养系统，研究人员在体外验证了基质/底物刚度对CRC细胞中这些关键基因表达的影响。最后，评估CRC和癌旁正常组织中SDC1蛋白表达，以进一步证实其临床相关性。本研究从机械生物学角度为CRC预后评估和靶向干预提供新的理论和实验基础。

研究结果如下。机械敏感基因集活性在CRC细胞群体间存在差异：研究人员从已发表的DLD-1结直肠腺癌细胞在软基底（2和55 kPa）与胶原包被玻璃对照培养的转录组数据集中编译基因集。与对照相比，2和55 kPa基底分别鉴定出1,655和1,432个差异表达基因（DEGs）（|log₂FC| ≥ 2），两种条件下持续差异表达的323个基因被定义为机械敏感基因。单细胞RNA测序数据来自3例CRC肝转移患者，经Harmony去除批次效应后，16个簇被注释为8种主要细胞类型。基于323基因集，T细胞和肿瘤细胞机械敏感评分较高，肥大细胞和髓系细胞评分较低；原发肿瘤样本机械敏感评分显著高于配对肝转移样本，但差异幅度不大。基于中位评分将细胞分为高、低机械敏感性组，FindMarkers鉴定出284个显著DEGs（false discovery rate [FDR] < 0.05，|log₂FC| > 1），定义为CRC组织机械敏感基因特征。鉴定CRC肝转移相关基因：研究人员整合单细胞和批量转录组数据，采用差异表达分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA）。在GSE41258、GSE49355和GSE81558中用limma包鉴定肝转移与原发肿瘤间DEGs，FDR < 0.05且|log₂FC| ≥ 1；单细胞FindMarkers鉴定出517个DEGs。WGCNA软阈值分别为5、4、5，signed R²均大于0.85；GSE41258黑色模块、GSE49355黄色模块和GSE81558绿色模块与肝转移表型相关性最显著（R = 0.68）。整合后得到1,708个CRC肝转移相关基因。构建机械敏感肝转移相关预后特征：将机械敏感基因特征与肝转移相关基因取交集，获得178个候选基因；在TCGA-CRC中单因素Cox回归鉴定出20个与总生存显著相关基因。Mime包整合10种机器学习算法及组合共117个模型，在三个独立CRC队列中构建模型。Lasso+GBM平均C-index最高（0.69），但包含10个特征基因；StepCox[both]+GBM仅使用SNX7、SDC1、CDCP1、PTGES、EMP2和CALB2六基因，C-index为0.68，基于模型简洁性和临床实用性被选为最优预后特征。基于六基因表达和风险系数计算风险评分，以中位风险评分分层；Kaplan-Meier分析显示高风险组在全部队列中预后显著更差，且高风险评分患者具有更晚期临床病理分期。模型验证与评估：受试者工作特征（ROC）曲线显示，TCGA-CRC队列1、3、5年曲线下面积（AUC）分别为0.794、0.775和0.815；GSE38832为0.664、0.725和0.699；GSE41258为0.725、0.654和0.621。Meta分析显示风险评分为总生存较差的显著预后因素（TCGA-CRC：HR = 5.41，p < 0.001；GSE38832：HR = 3.80，p = 0.003；GSE41258：HR = 1.77，p = 0.005）。与74个已发表CRC预后特征比较，本模型在TCGA-CRC和GSE41258中C-index最高，在GSE38832中排名第二，并在1、3、5年AUC中排名靠前。独立预后分析：TCGA-CRC单因素分析显示机械敏感风险评分与总生存显著相关（HR = 8.395，95% CI：5.733–12.292，p < 0.001）；多因素校正后仍为独立预后因素（HR = 5.386，95% CI：3.435–8.445，p < 0.001）。整合风险特征和关键临床特征构建列线图，校准曲线显示预测与观察生存概率高度一致，1、3、5年AUC分别为0.843、0.827和0.848，决策曲线分析（DCA）显示其净获益高于单独临床特征。机械敏感风险特征的潜在分子机制：高、低风险组间鉴定出2,229个DEGs（FDR < 0.05，|log₂FC| > 0.25），其中869个上调、1,360个下调。上调基因的GO富集主要涉及细胞外基质（ECM）组织、细胞外结构组织、含胶原ECM、内质网腔、基底膜、整合素结合和胶原结合；KEGG富集包括细胞骨架、PI3K-Akt信号通路和黏着斑。下调基因GO富集涉及染色体分离、有丝分裂核分裂、细胞器裂变、线粒体基质、染色体区域、连接酶活性、NADP结合和核糖体结合；KEGG富集包括细胞周期、辅因子生物合成、过氧化物酶体、脂肪酸代谢、PPAR信号通路、核苷酸糖生物合成和核质运输。风险特征与肿瘤免疫微环境的关系：CIBERSORT分析显示高风险组调节性T细胞和M0巨噬细胞显著升高，静息树突状细胞、记忆CD4⁺ T细胞和浆细胞降低。相关热图提示CALB2、PTGES、CDCP1和SDC1可能与巨噬细胞极化相关，SNX7可能参与树突状细胞调节，EMP2与浆细胞存在一定相关。ESTIMATE算法显示高风险组基质评分和ESTIMATE评分显著更高，低风险组肿瘤纯度更高。风险特征与体细胞突变模式的关系：瀑布图显示高、低风险组前15位突变基因大体一致，但总突变率高风险组为96.28%，低风险组为92.24%；APC和TP53在两组中突变频率最高，KRAS突变频率在低风险组更高，而高风险组MUC16、SYNE1和FAT4突变频率更高。错义突变、无义突变和移码缺失为主要突变类型。风险特征与预测治疗反应的关系：肿瘤免疫功能障碍与排斥（TIDE）平台预测显示，高风险组TIDE评分、排斥评分和功能障碍评分显著升高，微卫星不稳定性（MSI）评分较低；TIDE评分与风险评分显著正相关。药物敏感性分析中，奥沙利铂、喜树碱和顺铂的估计IC₅₀在高、低风险组间无显著差异，而环磷酰胺IC₅₀在高风险组显著更高。六基因特征对底物刚度呈细胞系依赖性反应：基于既往分析，CDCP1、SNX7和EMP2被归为潜在抑癌基因，SDC1、PTGES和CALB2被预测为潜在癌基因。qRT-PCR显示，与NCM460相比，CDCP1、SDC1和PTGES在多数CRC细胞系中升高；CALB2仅在RKO显著升高；SNX7和PTGES在Caco-2和HCT15中上调，Caco-2最明显；EMP2在Caco-2显著上调。RKO和Caco-2在TCP、1 kPa和60 kPa培养48 h后，RKO在60 kPa下CDCP1、SNX7、EMP2、PTGES和CALB2下调而SDC1上调；Caco-2在60 kPa下CDCP1、SNX7、EMP2、SDC1、PTGES和CALB2上调。六基因呈刚度相关但细胞系依赖性表达，SDC1在测试条件下表现出最一致的刚度相关上调。SDC1在CRC细胞和组织中上调并响应底物刚度：Western blot显示SDC1蛋白在多种CRC细胞系中高于NCM460，Caco-2较强，RKO、DLD-1、HCT116和HCT15可检测。RKO在1和60 kPa下SDC1表达较TCP升高，60 kPa最高；Caco-2在水凝胶培养下较TCP升高；DLD-1在刚度调节下升高，尤其60 kPa。免疫组织化学显示CRC组织SDC1染色强于癌旁组织，免疫反应评分（IRS）显示CRC组织（n = 75）显著高于癌旁组织（n = 39），并在33对配对样本中确认。敲低SDC1抑制DLD-1细胞中刚度相关迁移和侵袭：在DLD-1中，shRNA1和shRNA3显著降低SDC1 mRNA，shRNA1敲低效率最强，并被选用于后续实验；Western blot确认shSDC1细胞中SDC1蛋白显著降低。Transwell实验显示，60 kPa培养的NC细胞迁移和侵袭能力较TCP增强，而SDC1敲低在TCP和60 kPa条件下均显著降低迁移和侵袭。Western blot显示60 kPa培养增加SDC1、paxillin和vinculin表达，而SDC1敲低在TCP和60 kPa下均降低这些蛋白表达，支持SDC1与刚度增强迁移/侵袭及黏着斑相关重塑之间的功能关联。

关键技术方法概括：研究人员使用GSE178318中3例CRC患者原发肿瘤和配对肝转移单细胞RNA测序数据；以TCGA-COAD和TCGA-READ合并的TCGA-CRC为训练集，GSE38832和GSE41258为外部验证集，GSE81558、GSE49355和GSE41258用于肝转移相关基因分析；组织芯片来自上海芯超。主要方法包括单细胞转录组、批量RNA-seq、WGCNA、Mime包整合117种机器学习模型、qRT-PCR、western blot、IHC、刚度可调聚丙烯酰胺水凝胶（1和60 kPa）、Transwell迁移/侵袭及SDC1 shRNA敲低。细胞系来自HySigen Biosciences Inc.。

讨论部分总结：CRC在中国为第二常见恶性肿瘤，远处转移是预后不良的主要原因。机械微环境在肿瘤发生和进展中具有重要作用，结直肠持续承受多种机械力，但机械敏感基因与CRC预后关系仍 largely 未充分探索。该研究首次整合机械敏感特征与肝转移风险，六基因模型为CRC个体化预后评估提供新生物标志物，并为靶向肿瘤机械微环境的治疗策略奠定理论基础。讨论还逐基因分析：SNX7参与蛋白分选、内吞和内体信号，在多种肿瘤中与进展、治疗抵抗和不良预后相关，本研究提示高SNX7可能有利预后（HR = 0.359，p < 0.001）；CDCP1为跨膜糖蛋白，在多种实体瘤过表达，本研究单因素Cox提示其可能为保护因素（HR = 0.395，p = 0.008），并与M0和M1巨噬细胞相关；PTGES通过调节PGE₂合成影响化疗抵抗和免疫逃逸，高PTGES与生存降低相关（HR = 1.398，p = 0.038）；EMP2作用具癌种异质性，本研究提示其可能为保护因素（HR = 0.459，p = 0.002）；CALB2调节细胞内钙信号、转移和化疗敏感性，与机械刺激关系尚未直接报道；SDC1即CD138，为跨膜硫酸肝素蛋白聚糖，在多种癌症中促肿瘤，但CRC中表达报道不一致。本研究在75例CRC和39例癌旁组织及33对配对样本中显示CRC组织SDC1升高，单因素Cox提示SDC1为风险因素（HR = 2.042，p = 0.047），敲低SDC1减少迁移和侵袭并改变黏着斑相关蛋白。研究扩展认为，六基因模型提示结直肠机械力并非被动旁观者，而是促进转移转录程序的主动驱动因素；SDC1为最一致刚度响应候选，其他五个基因反应异质，六基因特征应主要解释为预后和转移相关转录模型，而非统一刚度调节模块。局限包括机械敏感基因集来自单一DLD-1体外研究，单细胞分析仅3对样本，CAFs评分较低不排除其在ECM产生和重塑中的作用，原发肿瘤评分略高肝转移不应直接解释为组织刚度，AFM曾显示CRC肝转移可能更硬，差异可能反映组织水平机械特性与机械传感相关基因表达差异；需更大独立数据集和前瞻性多中心验证；TIDE和oncoPredict分析为探索性；需肝细胞共培养或肝模拟3D模型；SDC1机制需研究YAP/TAZ和整合素信号；水凝胶实验仅两个CRC细胞系。

研究结论部分翻译：本研究在开发预后特征之外，提出一个与CRC进展相关的潜在机械生物学程序。六基因模型提示结直肠固有机械力并非被动旁观者，而是促进转移、尤其是肝转移的转录程序的主动驱动因素。尽管SDC1在验证实验中最一致地表现为刚度响应候选基因，其他五个特征基因在细胞系和刚度条件下表现出更异质性反应。这表明六基因特征应主要被解释为预后和转移相关转录模型，而非统一受刚度调节的基因模块。这些基因间异质性可能反映细胞系特异性分子背景、分化状态、致癌改变和内在机械转导程序。未来研究应优先阐明这些基因在机械转导中的情境特异性作用，并验证其治疗相关性。靶向该机械敏感程序关键组分，或许与常规疗法联合，可能为打断CRC转移级联提供新策略。