用于深部肿瘤光动力治疗中可控单线态氧释放及耐药性调节的自组装前药

《Biomaterials》：Self-assembly prodrugs for controlled singlet oxygen release and resistance modulation in deep-tumor photodynamic therapy

　　

# 摘要

光动力治疗（PDT）通过光敏剂介导的单线态氧（1O?）产生，实现对肿瘤在时空上的可控消融，但其在深部实体肿瘤中的应用仍受到光穿透深度有限和肿瘤缺氧的根本性制约。内过氧化物（EPOs）可逆地捕获和释放1O?，为克服上述限制提供了一条有前景的策略。然而，现有的基于EPOs的系统存在1O?释放受半衰期支配而缺乏控制以及利用效率低下的问题。此外，PDT诱导的氧化应激会上调诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，导致一氧化氮（NO）过度产生，从而淬灭1O?并促进适应性耐药。在此，我们报道了一种可实现按需释放1O?同时抑制NO介导耐药性的自组装纳米前药。一种两亲性前药L-NARG-SS-Py，由1O?储存用吡啶酮基团与通过谷胱甘肽响应性二硫键连接的iNOS抑制剂组成，与原卟啉IX共组装形成纳米前药（PPIX@L-NARG-SS-Py NPs）。在光照下，产生的1O?被捕获并以EPO中间体形式储存，随后在肿瘤微环境中通过谷胱甘肽触发释放。同时，释放的iNOS抑制剂抑制NO的产生，从而减少1O?的淬灭并放大氧化损伤。在深部胰腺肿瘤模型中，该纳米前药实现了强效的肿瘤抑制作用，且系统毒性极低。本工作建立了一种生物学放大、不依赖光照的PDT策略，用于克服深部组织光疗中的物理和适应性耐药。

# 引言

光动力治疗（PDT）作为一种微创且经临床批准的疗法，已应用于浅表恶性肿瘤和皮肤疾病的治疗，这得益于其时空可控性和良好的安全性[1], [2]。通过外光源激活光敏剂（PSs）产生细胞毒性活性氧（ROS），特别是单线态氧（1O?），PDT可选择性地清除恶性组织，同时最大程度地保护周围正常细胞[3], [4]。然而，尽管已在临床上取得成功，PDT在深部实体肿瘤中的广泛应用仍受到两个固有的、长期存在的障碍的严重限制。首先，激发光的有限穿透深度从根本上限制了PS在深层肿瘤组织中的激活[5]。即使在近红外照射下，生物组织中的显著光学衰减也会导致肿瘤内ROS产生不足，从而引起异质性治疗反应和亚最佳的治疗效果[6], [7]。其次，缺氧肿瘤微环境（TME）作为大多数实体肿瘤的标志性特征，构成了PDT疗效的关键生物学屏障[8], [9]。由于传统PDT依赖分子氧（O?）作为ROS产生的底物，肿瘤内的O?耗竭和慢性缺氧会显著抑制1O?的产生并降低细胞毒性效率[10], [11]。综上所述，这些物理和生物学局限性严重削弱了PDT在深部和缺氧肿瘤中的治疗潜力，凸显了开发替代策略的迫切需求，即解耦ROS介导的细胞毒性与对光穿透和氧供应的依赖。

为应对这些挑战，内过氧化物（EPOs）最近作为一种创新的功能性中间体类别，出现在先进的PDT研究中[12], [13]。EPOs作为"1O?电池"的概念代表了PDT设计范式的重要转变。在该策略中，光产生的1O?通过可逆的Diels-Alder环加成反应被化学捕获并储存在EPO结构中，随后通过逆Diels-Alder反应以不依赖光照的方式释放[14], [15], [16]。因此，EPOs系统提供了两个显著优势。第一，1O?以化学稳定但可逆的形式储存，允许将ROS递送到激发光无法到达的深部肿瘤，从而缓解传统PDT的深度限制。第二，1O?的捕获通常在体外O?充足的条件下实现，在一定程度上绕过了体内治疗中ROS产生所面临的严格O?依赖性限制。

尽管具有这些优势，但目前报道的EPOs系统的治疗性能仍远未达到最佳水平，仍有巨大的改进空间。具体而言，两个关键限制阻碍了基于EPOs的PDT的充分发挥。(1) 大多数现有系统依赖于被动给药的氧化态EPO载体，其中1O?的释放主要由固有的化学半衰期而非肿瘤特异性刺激所支配[17], [18]。这种被动且时间依赖性的释放缺乏精确的时空控制，导致ROS过早耗散和在位治疗效率降低[19]。(2) 尽管EPOs允许暂时储存1O?，但可释放1O?的总量本质上有限，且释放的1O?在生物系统中仍面临极短的寿命和有限的扩散半径的问题[20], [21]。因此，相当比例的1O?在到达关键细胞内靶点之前就会被迅速淬灭或消耗，严重限制了ROS的利用效率。值得注意的是，越来越多的证据表明，1O?诱导的氧化应激可强烈上调肿瘤细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，作为氧化还原适应性存活反应的一部分，导致持续的一氧化氮（NO）过度产生[22], [23], [24]。这种过量的NO会快速清除ROS并激活细胞保护性信号通路，从而形成一种生化防御机制，削弱ROS介导的细胞毒性并促进治疗耐药[25], [26]。

近年来，前药策略作为一种有效的方法已经出现，通过化学掩蔽活性分子并使其能够响应特定生物刺激进行可控激活[27], [28]。这些策略可以改善药代动力学性质，减少脱靶毒性，并增强治疗精确性[29], [30]。其中，小分子自组装前药具有独特的优势，能够合理设计TME响应性系统，具有高载药效率、结构稳定性以及多种功能组分精确共递送的能力[31], [32]。因此，通过将疏水性的1O?储存EPO单元与亲水性的iNOS抑制剂通过TME响应性连接子共价整合，可以构建一种单一的多功能前药，该前药无需惰性载体即可自组装成稳定的纳米前药[33]。这种自组装纳米前药确保了所有功能基元的同步递送和激活。这种设计对于EPOs系统特别有利，因为后者需要协调调节1O?储存、按需释放和下游ROS介导的生物学反应，以实现最佳治疗效果。

基于上述考虑，我们提出了一种基于EPOs的自组装前药，整合了TME响应性1O?释放与NO耐药抑制，以克服PDT在深部肿瘤中的固有局限性。如图1所示，一种多功能前药L-NARG-SS-Py通过谷胱甘肽（GSH）响应性二硫连接子将EPO前体（3-乙酰吡啶酮）与NOS抑制剂N'-硝基-L-精氨酸（L-NARG）[34]共价偶联而合理设计而成，从而赋予所得分子固有的两亲性。3-乙酰吡啶酮基团通过形成EPO实现高效的1O?捕获，而吡啶醇-吡啶酮互变异构则赋予了一种对TME响应的、化学可编程的"OFF-ON-OFF"1O?释放行为。在这种两亲性结构的驱动下，L-NARG-SS-Py与光敏剂原卟啉IX（PPIX）自发共组装形成均匀的、无载体的EPOs纳米前药（PPIX@L-NARG-SS-Py NPs）。在体外光照下，PPIX@L-NARG-SS-Py NPs高效地将光产生的1O?捕获为稳定的EPO中间体，产生活化形式PPIX@L-NARG-SS-Py NPs（EPOs）。在肿瘤中蓄积后，细胞内高水平的GSH触发1O?和L-NARG的同步释放，实现同步的氧化细胞毒性和iNOS介导的NO产生的抑制，从而显著增强ROS的治疗效率。为进一步改善系统稳定性和肿瘤选择性，PPIX@L-NARG-SS-Py NPs经DSPE-PEG-PTP功能化以靶向膜联蛋白1，这是一种在胰腺癌细胞中过表达的膜生物标志物[35]。体内研究表明，活化的PTP/PPIX@L-NARG-SS-Py NPs（EPOs）在深部胰腺肿瘤模型中表现出延长循环、增强的肿瘤蓄积和显著的生长抑制作用，同时保持极低的系统毒性。综上所述，本工作建立了一种化学可编程的基于EPOs的自组装纳米前药，整合了可控的1O?储存-释放与NO耐药调控，为克服PDT固有的物理和生物学屏障以及推进以ROS为中心的治疗提供了一种通用化策略，用于深部肿瘤治疗。

# 章节摘要

## 纳米前药的制备与表征

L-NARG-SS-Py NPs采用一步纳米沉淀法制备。简要而言，将L-NARG-SS-Py（5.0 mg）溶解于1.0 mL二甲基亚砜（DMSO）中，在室温下超声处理（200 W，40 kHz）10分钟，并逐滴加入9 mL去离子水中。所得纳米颗粒分散液通过透析（MWCO = 1000 Da）在去离子水中纯化24小时，定期更换水，然后冷冻干燥得到L-NARG-SS-Py NPs。PPIX@L-NARG-SS-Py

## L-NARG-SS-Py的分子设计实现单线态氧储存并克服PDT耐药性

为构建一种能够克服iNOS来源的NO耐药性同时增强PDT疗效的前药系统，我们合理设计了一种GSH响应性的L-NARG衍生前药L-NARG-SS-Py，以及一种非氧化还原响应性对照物L-NARG-CC-Py。在两种结构中，iNOS选择性抑制剂L-NARG均与基于吡啶鎓的EPOs基团共价偶联。L-NARG-SS-Py采用可在GSH触发下裂解的二硫（-SS-）连接子，实现快速细胞内

## 结论

总之，我们开发了一种化学可编程的基于EPOs的自组装纳米前药，解决了传统光动力治疗的关键局限性。通过将1O?储存的内过氧化物单元与NO调控模块通过GSH响应性连接子整合，合理设计的前药L-NARG-SS-Py实现了储存的1O?和L-NARG的协调细胞内释放。这种双功能设计在化学上捕获了短暂的

---

**CRediT作者贡献声明**

Bowen Li：写作——审阅与编辑，监督，项目管理，获取资金，概念构思。Zhiyao Li：写作——初稿撰写，调查研究，数据整理，概念构思。Ronglin Chen：写作——审阅与编辑，项目管理，获取资金。Jianwu Tian：监督，概念构思。Wei Yang：调查研究，数据整理。Guiyang Zhang：方法论。Qianqian Liu：方法论，形式化分析。Jundong Zhou：形式化分析。Yuqing Wu：方法论。

**利益冲突声明**

作者声明不存在利益冲突。

**数据可用性**

支持信息可在xxx免费获取，附有额外方法、图表和补充结果（PDF）。

**竞争利益声明**

? 作者声明他们不存在任何已知的可能影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

**致谢**

作者感谢以下机构的资金支持：国家自然科学基金（编号22667008）；中国博士后科学基金（编号2026M793909）；安徽医科大学BSKY科学研究基金（900206）；深圳市医学研究基金（C2401019）和龙岗区医学学科建设基金（无可用的资助编号）；贵州省基础研究计划（自然科学）（编号qianhejichu-MS [2025] 688）。

Zhiyao Li | Wei Yang | Jianwu Tian | Qianqian Liu | Guiyang Zhang | Yuqing Wu | Jundong Zhou | Chongzhi Wu | Yihui Ai | Yanni Wang | Ronglin Chen | Bowen Li