热敏性和肿瘤靶向天冬酰胺酶融合蛋白实现实体肿瘤的代谢-免疫疗法

《Biomaterials》：Thermosensitive and Tumor-Targeted Asparaginase Fusion Protein Enables Metabolic-Immunotherapy for Solid Tumors

　　

摘要

靶向肿瘤氨基酸依赖性的代谢疗法，以天冬酰胺酶（ASNase）为代表，在实体瘤中疗效有限，原因在于其稳定性差、渗透性低且免疫原性高。在此，我们通过AlphaFold2设计了一种热敏性肿瘤靶向的ASNase融合蛋白（ASNase-ELP-LHRH），通过整合弹性蛋白样多肽（ELP）和黄体生成素释放激素（LHRH）来克服这些缺陷。ELP驱动原位储存库的形成，将半衰期延长至约400小时（提高95倍），并将抗ASNase抗体水平降低70倍。LHRH介导受体依赖性肿瘤靶向和深层渗透。ASNase-ELP-LHRH实现持久性的天冬酰胺（Asn）耗竭，对抗代谢适应性，诱导营养饥饿和细胞凋亡。从机制上看，该构建体通过下调Twist1和上调E-钙粘蛋白抑制上皮-间充质转化，从而阻断转移，在三阴性乳腺癌模型中有效抑制肺转移25天。我们进一步观察到在Asn耗竭下CD8⁺T细胞效应标志物表达的时间依赖性变化，其特征为IFN-γ和颗粒酶B表达的动力学改变。与抗PD-L1联合使用，实现了对抗肿瘤免疫的"双重增效"，持久抑制转移40天，并将生存期延长1.5倍。该模块化的配体可交换平台为蛋白质优化提供了一种可推广的策略，并确立了ASNase-ELP-LHRH作为实体瘤有前景的代谢免疫治疗药物的地位，架起了蛋白质工程、肿瘤代谢与癌症免疫学之间的桥梁。

引言

代谢重编程是驱动癌细胞增殖、存活和转移的标志[1]、[2]、[3]。虽然这些适应性代谢重塑赋予恶性细胞竞争优势，但也创造了可干预的治疗漏洞[4]、[5]。目前，已开发出两种主要策略来利用这一致癌标志：开发靶向失调代谢通路的小分子药物，以及限制肿瘤微环境（TME）内的营养供应。迄今为止，包括天冬酰胺（Asn）[6]、[7]、[8]、谷氨酰胺[9]、[10]、蛋氨酸[11]、[12]和色氨酸在内的多种氨基酸已被鉴定为肿瘤生长和免疫逃逸的关键调节因子，成为代谢癌症治疗的有吸引力靶点[13]、[14]、[15]、[16]。值得注意的是，氨基酸对T细胞中的蛋白质合成和代谢稳态也是不可或缺的，而T细胞正是在TME中调控抗肿瘤免疫反应的细胞[17]、[18]、[19]。在此背景下，氨基酸需求旺盛的肿瘤细胞可通过竞争性营养截留来抑制效应T细胞功能。因此，一种最优的靶向代谢抗肿瘤策略不仅需要抑制肿瘤进展和转移，还需保持或增强T细胞的代谢适应性以提升抗肿瘤免疫——这种方法有望与免疫疗法相结合，改善癌症患者的临床预后。

Asn不仅作为蛋白质生物合成的核心底物，还作为一种氨基酸交换因子，促进细胞外氨基酸摄取，从而维持癌细胞增殖[8]。此外，它还通过调节脂质、核酸及其他生物分子的同化通路发挥多效调控作用，使其成为肿瘤代谢治疗的有前景靶点[8]、[10]、[16]。临床证据表明，原发实体瘤中天冬酰胺合成酶（AsnS）表达升高与癌症患者转移复发的风险增加相关；临床前研究进一步证明，Asn剥夺可通过阻断转移过程中肿瘤细胞的上皮-间充质转化（EMT）来抑制三阴性乳腺癌（TNBC）的转移[20]、[21]。药理学Asn耗竭也被证明可通过代谢重编程和对氧化应激的适应性反应增强CD8⁺T细胞的代谢适应性[22]、[23]、[24]。

天冬酰胺酶（ASNase）——一种催化Asn水解为天冬氨酸和氨的酶——已获批用于血液恶性肿瘤的临床治疗，其疗效源于这些恶性细胞中固有的Asn合成酶（AsnS）缺陷，从而阻断Asn从头合成并使细胞依赖外源性Asn存活[25]、[26]、[27]。然而，ASNase无法有效抑制原发实体瘤生长[28]、[29]、[30]，这源于两个关键限制。第一，TME的代谢重编程使癌细胞能够适应营养剥夺：肿瘤细胞通过应激响应转录因子激活转录因子4（ATF4）上调AsnS，使其能在外源性Asn缺失时从头合成Asn以维持胞内Asn水平和恶性增殖[31]、[32]、[33]。第二，ASNase固有的不足之处，如稳定性差、药代动力学特性欠佳以及显著的免疫原性[34]，以及肿瘤蓄积不足和深层渗透能力不够，严重阻碍了其靶向TME的递送。因此，无法在全身循环和肿瘤实质组织中实现强效的Asn耗竭，也无法有效减少严重的脱靶毒性。近期工作集中于工程化ASNase-聚合物纳米偶联物和纳米药物以提高ASNase的稳定性和药代动力学特性，同时减轻其免疫原性[35]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]、[41]。虽然这些纳米平台在克服某些ASNase固有局限方面显示出前景，但它们缺乏针对实体瘤的主动靶向配体，导致内吞/转胞吞效率低、肿瘤蓄积和渗透欠佳，从而限制了其介导有效瘤内Asn耗竭以实现代谢治疗的能力。

为克服这些关键限制并实现基于ASNase的有效原发和转移性实体瘤治疗，我们通过将ASNase与热敏性肿瘤靶向多肽ELP(V)₉₀-LHRH进行基因融合，理性设计了一种多功能融合蛋白——ASNase-ELP(V)₉₀-LHRH。ELP(V)₉₀是一种热敏性、低免疫原性的多肽[39]、[42]、[43]、[44]，它赋予ASNase热敏性，在皮下注射后驱动缓释储存库的形成（图1a）；该修饰提高了ASNase的稳定性与药代动力学特性，同时减轻其免疫原性。黄体生成素释放激素（LHRH）作为肿瘤靶向配体，其受体在多种女性恶性肿瘤（包括TNBC）中过表达，但在健康组织中表达极低[45]、[46]、[47]、[48]，从而赋予融合蛋白肿瘤特异性趋向性，增强肿瘤蓄积和深层渗透。相应地，ASNase-ELP(V)₉₀-LHRH在循环和肿瘤组织中均实现强效的Asn耗竭。这种全面清除严重限制了组织中的Asn可用性，触发营养饥饿、细胞凋亡和EMT标志物的下调（图1b）。我们证明，ASNase-ELP(V)₉₀-LHRH与抗PD-L1——一种靶向程序性死亡配体1的免疫检查点抑制剂——联合使用，在TNBC小鼠模型中显示出更优的治疗效果。我们进一步观察到Asn耗竭后CD8⁺T细胞效应标志物表达的时间依赖性变化，其特征为IFN-γ和颗粒酶B表达早期降低、后期增强。ASNase-ELP(V)₉₀-LHRH介导的CD8⁺T细胞效应功能增强与抗PD-L1协同，强力放大抗肿瘤免疫，实现代谢-免疫治疗的叠加效应。

各节摘要

AlphaFold2辅助的ASNase-ELP(V)-LHRH设计

为支持结构设计和评估支架构型，我们采用AlphaFold2对具有不同ELP(V)长度的ASNase-ELP(V)-LHRH的四聚体结构进行建模（图2a），其中ELP(V)由重复的Val-Pro-Gly-Val-Gly（VPGVG）单元组成。AlphaFold2预测显示，ELP(V)-LHRH融合部分不会干扰ASNase从原聚体到四聚体的自组装。所形成的ASNase-ELP(V)-LHRH四聚体由ASNase四聚体核心被一层

讨论

代谢重编程和营养依赖性代表实体瘤中可利用的弱点[1]、[2]、[3]、[4]、[5]，然而将靶向氨基酸的疗法如ASNase转化为实体瘤治疗一直受到递送效率低下、药代动力学欠佳和肿瘤渗透不足的限制。在本研究中，我们通过AlphaFold2辅助的理性设计解决这些未满足的需求，开发了一种热敏性、肿瘤靶向的ASNase融合蛋白——ASNase-ELP(V)₉₀-LHRH——并且

CRediT作者贡献声明

Yuanzi Sun（孙元子）：调查。Fan Zhang（张帆）：方法学、调查。Linlin Han（韩琳琳）：方法学。Yanshuang Qi（祁衍双）：方法学。Sanling Huang（黄三灵）：资源。Yuxin Gong（宫宇鑫）：方法学。Jingcheng Xie（谢敬成）：撰写——审阅与编辑、监督。Like Gong（宫力克）：撰写——原始草稿、可视化、方法学、调查、形式分析、数据管理。Weiping Gao（高卫平）：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、监督、资源、经费获取、概念设计。Chuanhui Han（韩传辉）：监督，

数据可用性

支持本研究的数据可向通讯作者合理申请获取。

利益冲突声明

? 作者声明他们不存在已知的竞争性经济利益或个人关系，这些情况可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究获得中国国家自然科学基金（52473119资助W.P.G.；U24A20753和U24A20314资助X.B.W.；82470567和82070550资助S.T.Z.）以及国家重点研发计划（2021YFF0502900和2025YFE0218400资助X.B.W.；2022YFC2504003资助S.T.Z.）的支持。

Like Gong|Xuan Wang|Yinghao Zheng|Si Liu|Fan Zhang|Yuanzi Sun|Yanshuang Qi|Linlin Han|Yuxin Gong|Sanling Huang|Chuanhui Han|Jingcheng Xie|Shengtao Zhu|Xunbin Wei|Weiping Gao