具有免疫调节和成骨效果的可注射 pH 响应水凝胶用于修复糖尿病骨缺损

《Biomaterials Advances》：Injectable pH-responsive hydrogel with effects of immunomodulation and osteogenesis for repairing of diabetic bone defects

　　

• DMSN/Ca/Ce/GSH 表现出 pH 响应性和优异的骨传导性。
• Ce3?/Ce?? 和 GSH 在高血糖条件下实现了 pH 响应性释放，并针对性地改善了线粒体功能。
• 水凝胶通过离子效应和 GSH 调节炎症微环境。
• 水凝胶加速了糖尿病骨缺损中的血管新生和骨再生。

引言

糖尿病（DM）是一种以慢性高血糖和低度炎症为特征的全身性代谢性疾病，其全球患病率迅速上升，给医疗系统和人群健康带来了巨大负担[1], [2], [3]。在糖尿病骨微环境中，血糖波动诱导活性氧（ROS）的产生，从而放大炎症反应，并在骨缺损部位建立促炎环境[4], [5], [6]。此外，线粒体功能障碍、能量代谢失调和细胞内抗氧化防御受损共同驱动了过量 ROS 的产生[7], [8]，这已被证明会加剧炎症并阻碍骨修复。过量 ROS 进一步加重线粒体功能障碍，形成恶性循环。在糖尿病病理条件下，促炎细胞因子水平升高导致巨噬细胞（关键的炎症调节细胞）优先向 M1 表型极化，而 M2 巨噬细胞数量下降[9]。这种转变会加速炎症反应并进一步加剧细胞死亡。M1 表型过度极化可能会损害线粒体功能，这反过来可能会引发巨噬细胞中的假性缺氧和免疫失调[10], [11], [12]。这一级联反应导致 ROS 过度产生并放大炎症反应，建立了一个自我 perpetuating 的病理循环，最终延迟糖尿病患者的骨缺损愈合[13]。Wu 等人开发了一种智能响应性复合水凝胶，通过免疫微环境的时空调控以及血管生成和成骨分化的有效管理，有效清除过量 ROS 并诱导巨噬细胞向 M2 表型极化，从而显著促进骨形成和血管新生[14]。因此，开发一种能够破坏自我 perpetuating 的 ROS–线粒体损伤轴的智能化递送系统具有重要的临床和转化研究意义，可精确调控局部骨微环境，为糖尿病骨缺损愈合创造有利微环境。

鉴于糖尿病骨缺损的病理特征，水凝胶是填充骨缺损的优良材料。其孔隙率、可注射性和天然细胞外基质特性使其能够适应不规则缺损形态，同时表现出骨传导效应以引导组织再生并减少异体移植相关的炎症[15], [16], [17], [18], [19]。同时，糖尿病骨缺损的缺损周围组织微环境在早期炎症期通常呈酸性，这大大延缓了血管生成和骨缺损修复。Yang 等人开发了一种基于天然多酚衍生的黑磷的多功能水凝胶来解决糖尿病骨缺损问题，通过与温和光热疗法协同作用，复合水凝胶表现出抗氧化、抗炎和免疫调节特性，以及耦合的血管生成–成骨效应，最终实现了对骨再生微环境的程序化调控[20]。因此，设计一种能够响应周围环境 pH 值降解的复合水凝胶至关重要。针对这一问题，本研究使用席夫碱键制备了一种复合水凝胶。该水凝胶可以加速早期酸性微环境中水凝胶网络的水解，从而促进药物递送到缺损部位，同时为后续的骨再生提供结构支持。透明质酸（HA）是一种天然线性糖胺聚糖，具有高亲水性、低毒性和优异的生物相容性[21], [22]。先前的研究表明 HA 促进细胞粘附、增殖和成骨分化。此外，HA 植入物增强了骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨承诺，从而加速颅骨缺损愈合[22]。羧甲基壳聚糖（CMCS）是一种水溶性壳聚糖衍生物，由于其卓越生物相容性和内在生物活性，也被广泛用于伤口敷料、药物缓释制剂和其他生物医学应用[23]。因此，本研究选择 HA 和 CMCS 作为水凝胶网络基质。使用氧化透明质酸（OHA）和酰肼修饰的羧甲基壳聚糖（CMCS-CHD）基于席夫碱反应形成网络水凝胶，以修复糖尿病骨缺损。由于席夫碱在酸性环境中不稳定，水凝胶网络可以在治疗早期被迅速破坏。一旦骨缺损周围环境恢复正常，剩余的水凝胶为后期的成骨阶段提供支持。因此，它在整个治疗周期中发挥着至关重要的作用。

还原型谷胱甘肽（GSH）是一种 γ-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸三肽[24]。作为关键的细胞内氧化还原调节剂，它维持细胞氧化还原稳态，减轻氧化应激，促进代谢解毒并支持免疫细胞功能[25], [26]。Wang 等人证明 GSH 保护成骨细胞免受氧化应激，并激活 PI3K/Akt 信号通路刺激骨形成，显著增强糖尿病小鼠颅骨缺损再生[17]。铈离子（Ce3?/Ce??）属于稀土元素，具有抗氧化活性。Ce3?/Ce?? 可以像过氧化氢酶和超氧化物歧化酶一样作为催化剂，有效降低体内 ROS 水平[27], [28]。这种效应源于 Ce3? 和 Ce?? 状态之间在生理环境中的可逆氧化还原循环[29], [30], [31]。Zhang 等人[32] 和 Yu 等人[33] 均已证明 Ce3?/Ce?? 可以有效清除 ROS 并促进骨再生。钙（Ca2?）是人体骨基质的主要无机成分。此外，生理性细胞外 Ca2? 浓度关键调控成骨细胞增殖和向成骨谱系的分化[34], [35], [36]。

近年来，树枝状介孔二氧化硅纳米粒子（DMSN）因其卓越生物相容性、精确可调的树枝状孔道结构和高比表面积，已成为生物医学应用中递送治疗性生物分子和无机离子的多功能纳米平台[37], [38], [39], [40], [41], [42]。然而，传统 DMSN 合成通常依赖于多种有机溶剂和结构导向剂，无机前驱体（通常为金属盐）可能与这些有机物发生不希望的反应，导致介孔骨架结构畸变[43], [44]。此外，合成后为去除残留有机溶剂和结构导向剂所需的洗涤步骤往往会损害金属离子向 DMSN 骨架中的有效掺入[44], [45]。由于这些纳米粒子的合成工艺通常较为复杂，将治疗性金属离子整合到 DMSN 中仍然具有挑战性。Han 等人通过浸渍法将 Ca2? 掺入 DMSN。这种 Ca2? 的掺入保留了纳米粒子的树枝状介孔结构，同时保持了强健的再 矿化能力[46]。因此，在本研究中，通过浸渍法将 Ca2? 和 Ce3?/Ce?? 负载到 DMSN 中（定义为 DMSN/Ca/Ce），通过将 DMSN/Ca/Ce 与 GSH 进行酰胺化反应合成了载药 DMSN/Ca/Ce（定义为 DMSN/Ca/Ce/GSH）。

为了破坏糖尿病骨缺损微环境中炎症和线粒体功能障碍的自我 perpetuating 循环，本研究设计了一种由 DMSN/Ca/Ce/GSH、CMCS-CHD 和 OHA 组成的 pH 响应性可注射水凝胶，用于糖尿病相关骨缺损的靶向治疗（方案 1）。当含有 DMSN/Ca/Ce/GSH 的 CMCS-CHD/OHA 溶液被注射到形状不规则的糖尿病骨缺损中时，会原位快速形成一种复合水凝胶（定义为 CCOH@DMSN/Ca/Ce/GSH 水凝胶）。在缺损部位治疗的早期，水凝胶的席夫碱网络被炎症微环境中的酸性 pH 值破坏，使 DMSN/Ca/Ce/GSH 纳米粒子能够递送到炎症微环境中。随后，DMSN/Ca/Ce/GSH 纳米粒子中的 pH 响应性酰胺键断裂，精确快速地释放 GSH 到炎症微环境中，从而缓解活性氧应激和线粒体相关损伤。此外，作为硅酸盐基纳米载体，DMSN 在酸性炎症微环境中的降解促进了其负载的 Ca2? 和 Ce3?/Ce?? 的持续释放。通过可逆的 Ce3?/Ce?? 价态转变，Ce3?/Ce?? 表现出超氧化物歧化酶样活性，与释放的 GSH 协同作用以增强 ROS 清除能力，进一步优化炎症微环境的修复并减少线粒体损伤。随着炎症微环境中 ROS 的逐渐清除，水凝胶可以转变为再生性和骨传导性支架结构，促进长期骨形成。残留且未降解的 DMSN/Ca/Ce/GSH 纳米粒子持续向成骨细胞释放生物活性离子（Ca2?、Si?? 和 Ce3?/Ce??）。Ca2? 通过加速骨缺损愈合促进骨形成，Ce3?/Ce?? 有效刺激骨缺损内部及相邻区域的血管新生，从而有效解决糖尿病患者血管新生缓慢的核心问题，同时促进骨形成和血管新生。本研究开发了一种可注射且生物响应性的水凝胶，能够动态调节炎症微环境，并在时空上协调骨形成和血管新生，显示出在糖尿病骨缺损修复中的高转化潜力。

材料片段

材料

羧甲基壳聚糖（CMCS，阿拉丁，取代度 >90%），透明质酸钠（HA，阿拉丁，分子量 1.0 MDa），羰肼（CHD，阿拉丁，≥97%），高碘酸钠（NaIO?，阿拉丁，≥99.5%），1-乙基-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC，阿拉丁，≥98%），N-羟基丁二酰亚胺（NHS，阿拉丁，≥98%），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，阿拉丁，≥99%），十二烷基苯磺酸钠（SDBS，阿拉丁，≥95%），三乙醇胺（TEA，阿拉丁，AR），四乙氧基硅烷

纳米粒子的合成与表征

在本研究中，通过浸渍法将 Ca2? 和 Ce3?/Ce?? 负载到 DMSN 中，随后通过胺化 DMSN/Ca/Ce 与 GSH 的酰胺化反应合成 pH 响应性 DMSN/Ca/Ce/GSH 纳米粒子（图 1A）。由于 GSH 与纳米粒子之间形成了稳定的共价键，DMSN/Ca/Ce/GSH 纳米粒子中吸附的 GSH 量极少。使用 GSH 和 GSSG 检测试剂盒计算 GSH 的接枝效率为 58.98%。TEM 图像显示 DMSN/Ca/Ce/GSH...

结论

鉴于糖尿病骨缺损微环境的独特挑战，需要在不同阶段进行抗炎、血管生成和成骨干预，本研究成功开发了一种具有 pH 响应特性和免疫微环境调节能力的复合水凝胶（CCOH@DMSN/Ca/Ce/GSH）。该复合水凝胶表现出稳定的力学性能、优异的生物相容性、高效的 ROS 清除以及协同促进血管生成和...

CRediT 作者贡献声明

Junhui Jiang：撰写原稿，验证，调查，形式分析。Junbo Dang：资源，形式分析。Minna Ma：验证，资源。Qiaochu Fan：资源，形式分析。Tianhao Zhao：验证，资源。Nan Zuo：资源，形式分析。Yu Su：验证，资源。Dahui Sun：监督，资源，项目管理。Mei Zhang：撰写-审阅与编辑，项目管理，概念化。

资助

本研究由中国吉林省科技发展计划项目（20250201060GX）资助。

利益冲突声明

没有利益冲突需要声明。

Junhui Jiang | Junbo Dang | Minna Ma | Qiaochu Fan | Tianhao Zhao | Nan Zuo | Yu Su | Dahui Sun | Mei Zhang