3D生物打印双因子神经导管通过激活PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路促进神经血管共同再生

《Biomaterials》：3D-Bioprinted Dual-Factor Nerve Conduits Promote Neurovascular Co-Regeneration via Activation of the PI3K/AKT and MAPK/ERK Pathways

　　

摘要

跨越困难缺损的外周神经修复仍然是一个重大的临床挑战，部分原因在于传统的神经导管无法重建对协调再生至关重要的神经血管微环境。为了克服这一难题，我们设计了一种由海藻酸（Alg）、甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和细菌纳米纤维素（BNC）组成的3D生物打印多通道导管，并分别负载了含有神经生长因子（NGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米球以及来源于人乳牙牙髓干细胞（SHEDs）的施万样细胞（SC-SHEDs）。该导管在10毫米大鼠坐骨神经缺损模型中进行了评估。NGF和VEGF联合刺激与体内观察时间范围内持续的AKT和ERK磷酸化相关，同时伴有mTOR和c-Jun磷酸化的变化。所选择的配方保留了预期的打印几何结构，支持了短期细胞活力，并实现了两种因子的持续释放。在1个月和3个月的评估中，与未处理的对照组相比，NGF+VEGF+SC-SHED组显示出更高的微血管密度、更强的S100β和NF200相关信号、改善的髓鞘形态学、更好的电生理和感觉运动结局以及更高的腓肠肌保留率。该联合导管在工程化组中总体产生了最理想的结果，并且在几个终点指标上接近自体移植组。这些结果支持进一步评估这一综合策略用于外周神经重建。

引言

外周神经损伤（PNI）是一种严重的临床问题，主要由严重创伤、肿瘤切除或医源性损伤引起[1]，[2]。它通常导致感觉和运动功能的完全丧失、进行性去神经性肌肉萎缩以及难以控制的外周神经痛，从而给患者带来深远的生理和社会经济负担，并显著降低其生活质量[3]，[4]。其中，难以无张力进行端端吻合的神经缺损桥接仍然是一个主要挑战[5]，[6]。缺乏适当的物理和生物指导时，再生轴突经常会错误定向和分散，使得完全恢复原生感觉运动功能格外困难[7]。尽管自体神经移植仍然是缺损重建公认的临床金标准，但其广泛应用受到供体组织有限供应、不可避免的供体部位损伤、结构/束状不匹配以及疼痛性神经瘤形成可能性的内在限制[1]，[8]。因此，开发先进的组织工程神经导管（NGCs）作为自体移植的可行替代品已成为再生医学的主要前沿领域[9]，[10]。

理想的组织工程支架不仅需要有效桥接缺损，还应重建损伤部位的生物化学微环境[11]，[12]。然而，大多数传统NGC的一个主要限制是它们无法建立功能性微血管网络[13]，[14]。在较大的神经缺损中，氧气和营养物质的扩散距离受到严重限制，使得导管中心极易遭受缺氧和代谢剥夺[13]，[15]。这种恶劣的微环境导致浸润的施万细胞大量死亡，最终阻碍神经再生[16]，[17]。本质上，外周神经缺损的成功修复不仅取决于孤立的轴突延伸，而是依赖于神经血管网络的协调重建[18]，[19]。在这一再生生态位中，新生微血管不仅提供不可或缺的氧气和代谢支持，还作为施万细胞迁移和再生轴突延伸的物理轨道[20]，[21]。

为解决这一挑战，各种促血管生成策略已被引入神经导管中，包括直接掺入血管内皮生长因子（VEGF）[22]、通过内皮细胞共培养进行体外预血管化[23]以及利用宿主组织进行体内预血管化[24]。然而，大多数现有的神经血管再生策略要么专注于血管形成，要么专注于神经营养支持，而忽略了这两个过程之间的相互作用[25]，[26]。由于游离生长因子的半衰期短且在体液中迅速失活[27]，单一干预（如仅使用VEGF）不太可能提供持久的体内生物活性，因此需要受控的长期释放以更好地与延长的轴突生长过程相匹配[22]，[28]。一个真正的再生微环境应协调整合微血管重塑与神经营养信号传导。在这种系统中，微血管为组织修复提供营养和结构基础，而神经生长因子（NGF）直接支持神经元存活、轴突延伸和方向性引导。因此，阐明血管生成与神经再生之间的协同相互作用对于克服复杂神经重建的当前瓶颈至关重要。

NGF或VEGF与这些信号通路之间的关系已经确立。NGF可以参与PI3K/AKT依赖的存活信号传导并调节ERK激活[29]，[30]，[31]，而VEGF可以激活AKT和ERK信号[32]，[33]。在施万细胞中，ERK参与可塑性和修复相关的重编程[34]，[35]，而PI3K/AKT/mTOR参与分化和髓鞘化[36]，[37]。ERK和PI3K/mTOR之间的串扰也已被描述[38]。此外，mTORC1的短暂激活与施万细胞去分化过程中c-Jun的升高相关[39]，而mTOR信号传导促进髓鞘化和轴突生长[40]。因此，本文要回答的问题不是这些通路能否被激活，而是SC-SHEDs暴露于NGF、VEGF或其组合时，这些通路的磷酸化图谱如何随时间变化。

有效激活这一神经血管再生网络可能依赖于能够执行关键修复功能的外源种子细胞[41]。尽管自体原代施万细胞在外周神经修复中具有内在优势[42]，但其临床转化受到可及性有限、不可避免的供体部位损伤以及体外扩增过程中复制性衰老的严重阻碍[43]，[44]。SHEDs提供了一个实用的替代方案，因为它们可以从即将丢弃的乳牙脱落牙齿中获取，从而避免了外周神经活检及其相关的供体部位损伤[43]，[44]，[45]。它们的高增殖能力和克隆形成能力可能有助于生成支架制造所需的细胞数量，减轻（尽管不能完全消除）扩增相关限制[45]。它们来源于神经嵴外间充质组织的谱系和已报道的神经分化潜力也为诱导向施万样表型提供了生物学基础[45]，[46]。这些可及性、扩增和谱系相关特征是选择SHEDs进行本研究的理由。然而，在缺乏持续局部指导信号的情况下，干细胞来源的施万样细胞可能无法长期维持稳定的修复表型和旁分泌活性[47]。

在我们先前的工作中，我们证明了一种3D生物打印的海藻酸钠/GelMA/细菌纳米纤维素（Alg/GelMA/BNC）复合支架可以为施万细胞生长提供有利的拓扑空间并诱导一定程度的新生血管化[48]。然而，仅依靠支架结构的被动引导不足以在缺损核心建立高效的神经血管偶联网络[13]。在此，我们设计了一种复合导管，整合了SHED来源的施万样细胞（SC-SHEDs）与分别制备的负载NGF和VEGF的PLGA纳米球以实现双因子持续释放。该研究围绕一个主要生物学目标和一个支持性细胞学目标组织。主要目标是确定该整合导管是否能改善10毫米大鼠坐骨神经缺损中血管和神经修复的时间进程。支持性目标是在体外表征SC-SHEDs对NGF、VEGF及联合刺激的时间依赖性磷酸化反应，重点关注PI3K/AKT/mTOR、MAPK/ERK和c-Jun。我们假设联合刺激将产生比单一因子更持久的磷酸化反应，且整合导管将比部分处理导管支持更大的神经血管修复。实验设计的创新之处在于将SC-SHEDs对联合因子刺激的时间分辨分析与体内评估一种设计用于持续双因子递送的导管相结合，而非鉴定个体信号通路。信号分析旨在鉴定与处理相关的细胞反应，本身并未检验这些通路是否引起了体内效应。本研究流程图见图1。

章节片段

SHEDs经诱导后获得施万样标志物表达和营养特征

化学诱导后，SHEDs呈现出细长的梭形形态（图2）。免疫荧光染色显示，SC-SHEDs中S100β和GFAP信号强于未分化的SHEDs。半定量分析证实，SC-SHEDs中相对S100β和GFAP荧光强度高于未分化的SHEDs（p < 0.05）。

与免疫荧光发现一致，qRT-PCR显示SC-SHEDs中S100β mRNA表达高于未分化的SHEDs（p < 0.001）。

配方依赖的可打印性和短期细胞相容性

跨越长间隙缺损的外周神经再生仍然具有挑战性，因为传统的中空神经导管仅提供基本的桥接，缺乏引导再生轴突所需的内部结构[49]，[50]，[51]，[52]，[53]。通过3D生物打印生产的多通道导管可能提供对内部几何结构的更大控制[54]，[55]，但生物墨水设计需要在挤压流动性和沉积后的形状保持之间取得平衡。虽然软水凝胶基生物墨水具有

结论

在本研究中，我们开发了一种3D生物打印多通道神经导管，集成了结构引导、持续NGF/VEGF递送和基于SC-SHEDs的细胞支持。在10毫米大鼠坐骨神经缺损中，该联合导管在1个月和3个月时支持了血管和神经组织修复，伴有电生理和感觉运动恢复以及靶肌肉萎缩减少。NGF/VEGF联合刺激与PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK磷酸化协调相关

实验部分

材料和试剂：胶原蛋白酶I和全反式视黄酸（ATRA）购自Sigma。中性蛋白酶和β-巯基乙醇购自Solarbio。FBS、α-MEM、青霉素-链霉素、PBS和胰蛋白酶购自Gibco。PE偶联抗人CD29、CD73、CD90和CD105抗体以及FITC偶联抗人CD34和CD45抗体购自BioLegend。毛喉素购自MedChemExpress，而bFGF、PDGF-AA、NRG-1、AKT和p-AKT抗体

CRediT作者贡献声明

朱昕宇：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿，方法论，调查研究。

高思勇：软件，项目管理，方法论，调查研究。

吴宗熙：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿，调查研究，资金获取，形式分析，数据管理，概念化。

吴宇民：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿，可视化，形式分析，数据管理，概念化。

梁宇杰：验证，监督，资源。

数据可用性声明

支持本研究发现的数据可由通讯作者根据合理请求提供。

伦理批准和参与同意

所有动物实验程序均经中山大学动物伦理委员会审查并批准（批准号：SYSU-IACUC-2025-001922），所有操作均严格按照《实验动物饲养和使用指南》进行。

人类乳牙脱落牙齿样本采集获得所有儿童供体法定监护人的书面知情同意，所有涉及人类样本的操作均符合《声明》的规定。

生成式AI声明

在准备本手稿期间，作者使用ChatGPT（OpenAI）作为AI辅助工具来改善文本的可读性和语言，包括语法润色、句子结构优化和学术措辞调整。所有AI生成的内容均由作者仔细审查、编辑和核实其准确性、完整性和科学严谨性，作者对手稿最终内容负全部责任。未使用生成式AI来

资助

本研究由中国博士后科学基金面上项目（项目编号：2022M723596）资助。

利益冲突声明

? 作者声明不存在可能影响本文报告工作的已知竞争性财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢中山大学光华口腔医学院口腔颌面外科和广东省口腔医学重点实验室提供实验平台和技术支持。作者还衷心感谢所有实验室同事在研究过程中对动物手术、样品检测和数据中心协助。

吴宗熙|吴宇民|朱昕宇|高思勇|王雅慧|邱敬健|卜柳瑶|贾婉婷|廖桂清|梁宇杰