评估磷酸二酯酶抑制剂在神经细胞模型中的作用以开发功能化壳聚糖微结构薄膜作为外周神经再生支架

《Biomaterials Advances》：Evaluation of phosphodiesterase inhibitors in neural cell models for the development of functionalized chitosan microstructured films as scaffolds for peripheral nerve regeneration

　　

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  西地那非促进神经突起生长和神经元中BDNF的表达。
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  罗利普兰诱导Krox20的表达，支持雪旺细胞髓鞘化。
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  已开发出西地那非功能化的甘油-壳聚糖薄膜用于神经修复。
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  功能化薄膜在仿生介质中实现西地那非的持续释放。
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  微结构软支架保留雪旺细胞的排列和迁移。

引言

生物材料是一种现代且有前景的策略，可用于解决周围神经损伤（PNIs）的修复问题。周围神经损伤是一项重大的临床挑战，常导致长期的功能障碍，原因是神经系统的再生能力有限[1]。尽管周围神经具有内在的再生能力，但成功的恢复高度依赖于存在一种允许性的微环境，该微环境支持雪旺细胞（SC）的迁移、轴突再生以及再生纤维的正确导向[2]。当前的临床方法往往受到限制[3]，这推动了朝着开发能够支持和促进周围神经再生的基于生物材料的支架的研究努力。

在各种研究的生物材料中，壳聚糖因其生物相容性、生物降解性和低免疫原性而成为一种特别有吸引力的候选材料[4]。在我们之前的研究中，基于壳聚糖的支架已证明能够支持神经元存活和轴突生长，且其物理化学性能可根据神经组织的要求进行调整。掺入甘油等增塑剂进一步改善了壳聚糖的柔韧性，使得制造适用于神经的柔软、力学相容的基底成为可能，非常适合神经再生应用。重要的是，基于壳聚糖的薄膜可以进行纳米和微结构加工，以引入模拟天然神经组织各向异性结构的地形线索[5]、[6]、[7]。我们已经证明了地形[6]、低刚度[8]、[9]及其组合在调节雪旺细胞反应中的作用，增强了支架的再生能力。简而言之，带有光栅（GR；即交替排列的脊和沟）的纳米/微沟槽图案可以促进雪旺细胞的排列、极化和定向迁移，这些都是形成Büngner带以及随后引导再生轴突所必需的。先前的研究还证明，GR基底能有效调节体外神经元的极化和行为[10]、[11]。此外，采用复杂的体外和离体神经模型（如神经-体外共培养、大鼠背根神经节离体标本）的测试证实，这些支架能够导向轴突生长，即使在 confluent 雪旺细胞层上也是如此[12]，凸显了地形线索作为引导神经再生的强效物理信号的潜力。此外，甘油混合壳聚糖薄膜此前已在神经损伤模型中进行体内评估[12]，证明该装置能够成功植入和缝合，并能充分支持体内周围神经再生。

另一方面，对细胞内信号通路的生物化学调控可能是一种有效策略，可进一步支持和促进神经再生。磷酸二酯酶（PDEs）是细胞内环核苷酸信号的关键调节因子，通过水解参与细胞存活、迁移和细胞骨架信号通路的第二信使（如cAMP、cGMP）发挥作用[13]。在这些PDE亚型中，PDE4和PDE5对于周围神经再生特别相关，因为它们分别能够调节cAMP和cGMP信号[14]。磷酸二酯酶抑制剂（PDEIs）增加了细胞内环核苷酸的含量，并放大了促进神经再生的信号通路[15]、[16]。事实上，cAMP和cGMP对神经再生过程有重大贡献，因为它们在轴突生长、神经元存活、雪旺细胞去分化/增殖以及神经营养因子的分泌中发挥作用[17]。具体而言，与一氧化氮（NO）信号密切相关的cGMP信号，诱导细胞骨架变化，并在损伤区域发挥神经保护和神经再生功能[18]。越来越多的证据表明，PDEIs在神经再生中发挥关键作用。特别是，PDE5抑制剂（PDE5Is）能够增强坐骨神经损伤后的神经再生[19]、[20]，并促进海绵体神经损伤后的功能恢复[21]。类似地，PDE4抑制剂（PDE4Is）通过其抗炎活性，在缺血性卒中、β-淀粉样蛋白诱导的神经退行性变和脊髓损伤的大鼠模型中发挥神经保护和神经再生作用[22]、[23]。此外，最近还证明了PDE4Is对雪旺细胞向髓鞘化表型分化的影响，该结果是在雪旺细胞和人类iPSC来源神经元的3D体外共培养模型上得出的[24]。多项临床前研究突出了PDEIs（如罗利普兰（PDE4I）和西地那非（PDE5I））在神经损伤模型中的潜在疗效[25]，尽管与药物全身分布可能相关的潜在副作用值得关注。这些限制突显了局部和可控的PDEIs药物递送方法的重要性。值得注意的是，西地那非和罗利普兰偶联至纳米球并在大鼠双侧海绵体神经损伤中局部递送，与明显的神经保护效果相关[26]。将PDEIs纳入生物材料支架为创建一种促进局部位点特异性药物释放并避免全身药物给药的平台提供了基础[27]。尽管这些策略前景广阔，但今天将PDEIs整合到用于神经再生的生物材料支架中仍然相对未被探索。

在本研究中，我们在体外评估了两种不同的PDEIs——西地那非和罗利普兰——对神经元和雪旺细胞模型的影响，以识别可能的支架功能化候选物。我们开发并优化了一种可重复的方案，以确定PDEIs对神经细胞模型的最佳递送浓度，以实现统计显著且可量化的生物学效果。然后，我们制备了功能化西地那非的甘油混合壳聚糖微结构薄膜，并研究了其物理机械性能、不同条件下的药物释放曲线、细胞相容性以及调节雪旺细胞形态和迁移的能力。通过将可控药物递送与定向微地形线索及神经组织力学相容特征相结合，本研究旨在为开发改善周围神经再生的多功能支架做出贡献。

章节摘要

50B11细胞

50B11感觉神经元细胞系（由美国约翰霍普金斯医学院Ahmet H?ke教授慷慨提供）[28] 在37°C、含5% CO?的湿润环境中单层培养。细胞在Neurobasal培养基（Life Technologies, Gibco）中维持，该培养基补充有10%热灭活胎牛血清（FBS；Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）、2% B27（Life Technologies）、0.22%葡萄糖（Sigma）和0.2 mM L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich）及1%

西地那非和罗利普兰对神经元和胶质细胞模型影响的体外分析

为了优化支架的功能化，进行了体外实验，以确定本研究所选两种PDEIs——即西地那非和罗利普兰——的效果及最佳递送浓度。体外研究在永生化运动NSC-34和感觉50B11神经元细胞系、大鼠DRG来源的原代感觉神经元以及永生化雪旺细胞系RT4-SCs上进行。

讨论

越来越多的证据凸显了PDEIs在促进神经再生中的关键作用，使它们成为周围神经损伤治疗干预的有力候选物。特别是，PDE5抑制剂（如西地那非）和PDE4抑制剂（如罗利普兰）在多个临床前模型中展现了显著的神经再生和神经保护效果，通过互补的机制增强轴突生长、调节炎症并

结论

本研究表明，西地那非和罗利普兰对周围神经再生具有互补的、阶段特异性的效应，促进神经突起生长并差异性调节雪旺细胞表型。西地那非增强早期促再生信号，而罗利普兰支持后期的髓鞘化过程，提示了一种时间可控的治疗策略。此外，西地那非可以有效整合入并经由微结构壳聚糖软支架释放，而不会损害

CRediT作者贡献声明

F. Fregnan： 撰写——初稿、监督、方法论、调查、形式分析。L. Scaccini： 调查、形式分析。M. El Soury： 调查。A. Battisti： 验证、监督、方法论。M. Mascelloni： 调查、数据整理。F. Zen： 调查。L. Muratori： 调查、形式分析。D. Puppi： 调查、方法论。M. Cecchini： 验证、监督、方法论。S. Raimondo： 撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、资金

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所述工作。

致谢

本研究由意大利研究与教育部资助：PRIN 2022征集项目，项目周围神经系统病理模型中纳米/微工程化器件的开发（ENGInerve）。

F. Fregnan|L. Scaccini|M. El Soury|A. Battisti|M. Mascelloni|F. Zen|L. Muratori|D. Puppi|M. Cecchini|S. Raimondo|I. Tonazzini