可注射氧化石墨烯-PEG/胶原蛋白水凝胶在糖尿病条件下实现受控Atsttrin/TNFR2信号传导及14-3-3ε依赖性骨再生

《Biomaterials Advances》：Injectable graphene oxide–PEG/collagen hydrogel enables controlled Atsttrin/TNFR2 signaling and 14-3-3ε–dependent bone regeneration under diabetic conditions

　　可注射的GO-PEG/胶原I水凝胶实现了Atsttrin长达七周的持续释放。负载Atsttrin的水凝胶增强了软骨生成和成骨分化。14-3-3ε对Atsttrin的再生反应有重要贡献。负载Atsttrin的水凝胶改善了糖尿病条件下的骨折愈合。该水凝胶表现出良好的细胞相容性、全身生物相容性以及体内延长保留。### 引言糖尿病患者的骨折带来了巨大的临床挑战，主要源于糖尿病本身对骨再生和愈合的内在损害[1]。糖尿病破坏了骨修复的精密调控级联反应，经常导致延迟愈合、骨不连以及次优的再生结局。糖尿病微环境以持续性低度全身炎症、细胞反应性降低、血管生成受损和异常的成骨信号传导为特征，这些因素协同作用，损害骨折愈合的关键时期[2]。再生医学的进展推动了创新治疗递送系统的开发，旨在解决骨愈合障碍带来的挑战。其中，水凝胶因其高度适应性的平台特性而备受瞩目，能够实现生物活性分子在损伤部位的局部化、持续释放[3][4][5][6]。近年来，骨和肌肉骨骼组织工程领域的研究集中在将结构支撑与生物活性相结合的复合支架上。细菌纤维素因其生物相容性、机械性能、多孔结构以及与其它生物材料修饰的适用性而受到特别关注。例如，将马来酸处理的细菌纤维素与明胶结合，改善了所得复合材料的可打印性和功能特性，支持其作为骨组织再生支架的应用。在另一种方法中，将木质素衍生的聚合物掺入透明质酸水凝胶中，创造出支持软骨修复的生物活性复合材料，展示了如何利用天然来源的功能组分来修饰局部再生环境。最近，通过原位发酵生产的细菌纤维素/纳米木质素支架被证明能够支持人骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，并增强体内骨再生。这些研究共同说明了复合生物材料如何被工程化以改善支架结构、机械性能和生物活性，为骨及相关肌肉骨骼组织的再生提供有利的微环境[7][8][9]。本研究选择了氧化石墨烯（GO）–聚乙二醇（PEG）/胶原I复合水凝胶，因为它整合了各组分的互补特性，实现了结构稳定性和生物功能。胶原I提供内在的生物相容性、可生物降解性以及促进骨愈合环境中成骨和软骨分化天然细胞粘附基序[10][11]。PEG提供可调的机械强度、亲水性和温度响应性凝胶化行为，实现微创可注射性和包封生物分子的持续释放[12]。GO的引入增加了额外的羧基和羟基，增强了共价交联密度、蛋白质结合亲和力和聚合物网络的机械强化[13]。此外，据报道GO可以通过调节细胞-基质相互作用来提高骨传导性并刺激成骨分化[13]。这三种组分的结合产生了一种具有优异机械完整性、可控降解和延长释放动力学的热响应水凝胶，使其特别适合在骨修复应用中局部递送Atsttrin等蛋白治疗药物。水凝胶设计为具有生物相容性和可定制的降解动力学，可以以时间控制的方式包封并逐渐释放骨诱导和抗炎剂，与骨修复的生理阶段相一致[14][15]。这种方法在糖尿病条件下尤其有利，因为持续炎症和失调的信号传导需要延长的、特定部位的治疗递送。通过水凝胶系统靶向递送生物活性分子可以促进炎症消退、增强成骨作用，并支持骨折部位有效的组织重塑，从而共同改善代谢受损受体的骨修复效果[16]。Atsttrin是一种由母体分子前颗粒蛋白工程化而来的治疗蛋白，在调节炎症反应和促进组织再生方面展现出巨大潜力[3][17][18]。它通过与肿瘤坏死因子受体（TNFRs）选择性相互作用来发挥其作用，对TNFR2表现出比TNFα显著更高的亲和力[19]。与通常与促炎信号相关的TNFR1不同，TNFR2主要介导抗炎和修复通路。通过与TNFR2的相互作用，Atsttrin下调炎症细胞因子的产生，同时增强促进细胞存活、组织完整性和基质重塑的再生信号级联[19][20]。重要的是，最近的研究确定了14-3-3 epsilon（14-3-3ε）作为TNFR2受体复合物的胞内组分[21][22]。具体来说，14-3-3ε被证明在软骨细胞和巨噬细胞中与TNFR2的胞内结构域相互作用，通过ERK/Elk-1和Akt/mTOR信号通路协调关键的抗炎和促再生反应[21][22]。TNFR2/14-3-3ε信号复合物在促进巨噬细胞向修复表型极化以及增强软骨基质稳态方面发挥着关键作用[22]。在骨关节炎、自身免疫性疾病和癌症模型中的体内研究表明，该通路的激活能显著保护组织免受退行性病变并促进愈合[22][23][24]。鉴于越来越多的证据表明14-3-3ε作为TNFR2受体复合物内的胞内信号介质，本研究旨在阐明14-3-3ε在协调Atsttrin在骨修复期间促再生效果中的功能角色。为了验证Atsttrin主要通过涉及14-3-3ε的TNFR2介导信号促进骨再生的假设，我们设计了一种热响应、可注射的GO-PEG/胶原I水凝胶，以实现Atsttrin的受控和持续局部递送。引入这种递送系统不仅是为了在生理相关环境中研究所提出的分子机制，也是为了克服游离蛋白递送在骨折部位快速扩散和酶解降解等固有局限性。通过确保Atsttrin的延长保留和生物活性，该水凝胶作为一种功能性生物材料平台，将机制洞察与转化治疗应用连接起来。同时，我们建立了一种诱导型14-3-3ε KO小鼠模型，并系统比较了骨愈合反应与WT或14-3-3ε fl/fl同窝对照的情况。为进一步探索代谢失调如何影响该信号轴，我们使用了1型糖尿病（T1DM）模型来研究受损的骨愈合。T1DM模型提供了一个一致且控制良好的环境，其中高血糖和胰岛素缺乏是主要的代谢应激来源。这使我们能够研究它们对骨修复的直接影响，而不受2型糖尿病（T2DM）中额外复杂性的干扰，如肥胖、脂质异常和慢性炎症[25][26][27]。这种方法使我们能够更具体地关注Atsttrin和14-3-3ε信号如何在糖尿病条件下贡献于成骨作用。从该模型中获得的见解可以为未来在T2DM和其它代谢性疾病中的转化研究奠定基础，在这些疾病中，额外的全身因素可能进一步扰乱骨再生。因此，通过整合遗传学、分子和组织学分析，本研究旨在定义14-3-3ε对Atsttrin介导的骨折修复的功能贡献。本研究整合了体外和体内模型，并使用了先进的成像模式和分子生物学技术，全面评估了负载Atsttrin的水凝胶如何在受损条件下影响骨修复的质量和进程。### 各章节摘要**材料与方法**除非另有说明，所有化学品均购自美国Sigma-Aldrich。所有与细胞分离、维持、操作和手术程序相关的方案均已提交并经耶鲁大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准。**水凝胶的流变学特性**在4°C至45°C的温度范围内表征了水凝胶的流变学特性，以评估其在生理相关条件下的热响应性和力学行为。储能模量（G'）和损耗模量（G''）在整个温度范围内均保持相对稳定，G''始终高于G'，表明主要表现为粘性行为（图1a）。这种粘弹性特征反映了水凝胶保持结构**讨论**水凝胶的流变学行为得到了仔细考察，以阐明驱动其溶胶-凝胶转变和温度依赖性力学响应的物理化学机制。水凝胶使用胶原、4臂PEG和GO配制，并纳入EDC/NHS化学以促进网络内的偶联反应。储能模量和复数粘度随温度从4°C升至45°C而逐渐增加，表明形成了更致密、机械强度更高的网络。这**结论**我们的研究证明14-3-3ε是Atsttrin再生效果的重要胞内介质，对于骨愈合期间观察到的完整治疗反应是必需的。这些发现为在糖尿病和炎症条件下开发靶向水凝胶骨再生疗法提供了坚实的机制基础。未来的研究应探讨如何调节14-3-3ε的活性或表达水平以进一步优化再生效果，**CRediT作者贡献声明****Lida Moradi：** 写作——审阅与编辑，写作——原稿撰写，项目管理，方法论，调查，形式分析，数据整理。**Lukasz Witek：** 写作——审阅与编辑。**Guiwu Huang：** 方法论。**Chuan-Ju Liu：** 写作——审阅与编辑，资金获取。**利益冲突声明**作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本研究中报告的工作。**致谢**本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）研究资助金支持，包括R01AR076900、R01AR062207、R01AR061484、R01AR078035和R01NS070328。Lida Moradi | Lukasz Witek | Guiwu Huang | Chuan-Ju Liu