原位抗菌温敏水凝胶作为糖尿病伤口治疗与分子监测的多功能平台

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：In situ antibacterial thermosensitive hydrogel as a versatile platform for diabetic wound therapy and molecular monitoring

　　

摘要：皮肤作为抵御外界刺激和环境变化的屏障。伤口是由物理或化学因素引起的皮肤结构损伤或破坏，其愈合过程复杂，涉及由细胞因子和其他介质调控的细胞和分子机制[1,2]。这一过程的紊乱可导致慢性伤口，无法有序或及时愈合。其中，糖尿病伤口尤为棘手，因为高血糖微环境会损害成纤维细胞的迁移和增殖，延长巨噬细胞驱动的炎症反应，并延迟向增殖期的转变[3,4]。在此背景下，慢性伤口的持续存在与正常愈合级联反应的受损进程密切相关，特别是炎症消退延迟及各阶段协调推进的破坏[3,5]。持续的促炎信号、氧化失衡和巨噬细胞功能障碍共同干扰了细胞外基质（extracellular matrix, ECM）形成、血管生成和成纤维细胞活性[3,4,5]。因此，促进炎症消退并支持同步化愈合阶段进展的治疗策略对于有效的糖尿病伤口修复至关重要。细菌定植和生物膜形成进一步使高血糖条件下的愈合复杂化[6]。因此，有效的糖尿病伤口管理需要既能预防感染，又能促进从炎症期快速过渡到增殖期的策略。在糖尿病伤口管理中，通常采用全身性或局部抗生素来预防和控制感染[7,8]。然而，传统抗生素的广泛和反复使用不可避免地导致了多重耐药菌株的出现，构成了严重的全球健康威胁[9,10]。长期或不恰当的抗生素给药不仅降低疗效，还会加速耐药性发展，从而限制了慢性和感染伤口的治疗选择[11]。在此背景下，能够在不依赖抗生素的情况下提供有效抗菌活性的替代方法，作为克服耐药性的有前景策略而日益受到关注。特别是非抗生素方法，如产生活性氧（reactive oxygen species, ROS）和多功能的治疗系统，为感染控制和伤口愈合提供了巨大潜力[12,13]。在本研究中，研究人员开发了一种生物相容性温敏水凝胶平台，旨在支持糖尿病伤口愈合和局部伤口管理。水凝胶因其高含水量、类细胞外基质结构以及在保持湿润愈合环境的同时维持生物活性分子的能力，被广泛应用于伤口护理[3,14,15]。温敏可注射水凝胶通过便于施加和粘附于伤口表面（尤其是不规则地形），同时最小化对脆弱组织的机械扰动，提供了实际优势[16,17,18]。该水凝胶系统由Pluronic F-127（PF, Poloxamer 407），一种热响应性聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物，和单宁酸（tannic acid, TA），一种植物源多酚交联剂组成[19]。PF可实现适用于伤口递送的流体-凝胶转变[20,21,22,23,24]，而TA通过多种相互作用（包括氢键、π-π堆积、金属配位和氧化偶联）有助于水凝胶网络稳定性。此外，TA提供了与伤口管理相关的多功能生物活性，包括抗氧化、抗炎和抗菌特性[25,26,27,28,29,30,31,32]。基于此材料体系，为了支持糖尿病伤口特征性炎症微环境的调控，研究人员引入了葎草（Humulus scandens (Lour.) Merr., HS）和葡萄（Vitis vinifera L., VV）提取物，两者均被报道具有抗炎作用，并评估了它们调节巨噬细胞活性和促进糖尿病伤口愈合的能力[33,34,35,36,37]。此外，为了实现糖尿病伤口愈合动态和阶段依赖性变化的实时分子水平追踪，研究人员引入了基于DNA修饰金纳米颗粒的mRNA纳米传感器（NanoFlares, NFs），该传感器先前用于细胞内mRNA检测，可在分子水平实现伤口愈合生物标志物的荧光监测[38]。选择了三个代表性靶标：与胶原沉积和细胞增殖相关的Col1a1 mRNA（编码胶原1型α1链）、指示炎症过程的Pecam1 mRNA（编码血小板内皮细胞粘附分子1）以及作为参照基因的Gapdh mRNA（编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶）。研究人员假设，PF/TA水凝胶系统将在提供抗菌活性、温敏可注射性和分子水平监测的同时，保持提取物的生物活性，从而为糖尿病伤口管理提供一个多功能平台。

研究背景与目的

皮肤是人体抵御外界刺激和环境变化的重要屏障。伤口愈合是一个涉及细胞和分子机制的复杂生理过程，受细胞因子等多种介质的精密调控。然而，当这一过程出现紊乱时，会导致慢性伤口的发生，其中糖尿病伤口因其独特的病理微环境而成为临床治疗的重大挑战。在高血糖环境下，成纤维细胞的迁移和增殖受到抑制，巨噬细胞驱动的炎症反应被异常延长，导致从炎症期向增殖期的转变延迟。这种持续的促炎信号、氧化应激失衡以及巨噬细胞功能障碍，共同阻碍了细胞外基质（ECM）的形成、血管新生和成纤维细胞的功能发挥。此外，细菌定植和生物膜形成进一步加剧了愈合困难。传统的抗生素疗法虽然常用于控制感染，但其广泛和不当使用已导致多重耐药菌株的涌现，严重威胁全球公共卫生。因此，迫切需要开发不依赖于传统抗生素、能够同时具备抗炎、抗氧化、抗菌以及促进组织再生功能的新型治疗策略。

研究内容与结论

为解决上述问题，本研究开发了一种新型的原位温敏水凝胶平台，旨在为糖尿病伤口治疗和分子监测提供一个多功能解决方案。研究人员利用Pluronic F-127（PF）的热响应特性，结合天然多酚交联剂单宁酸（TA），构建了具有可注射性和良好生物相容性的水凝胶基质。该水凝胶不仅能够在体温下发生溶胶-凝胶转变，适应不规则伤口形状，还通过TA的多种非共价相互作用增强了网络结构的稳定性。更重要的是，TA本身赋予了水凝胶抗氧化、抗炎和抗菌等多重生物活性，无需额外添加抗生素即可有效应对感染风险。

为了进一步调控糖尿病伤口特有的炎症微环境，研究人员将两种具有抗炎作用的植物提取物——葎草（HS）和葡萄（VV）提取物——整合进水凝胶中。体外实验表明，这些植物提取物能够有效调节巨噬细胞的极化状态，促进其从促炎的M1表型向抗炎的M2表型转换，这对于推动伤口从炎症期向增殖期过渡至关重要。

此外，该水凝胶平台的一个独特创新在于集成了分子水平的实时监测功能。研究人员引入了基于DNA修饰金纳米颗粒的mRNA纳米传感器（NanoFlares, NFs），分别针对代表胶原沉积（Col1a1 mRNA）、炎症过程（Pecam1 mRNA）和内参基因（Gapdh mRNA）的三种生物标志物。这使得在不侵入伤口组织的情况下，通过荧光信号的变化即可动态追踪伤口愈合过程中的分子事件，为个性化治疗方案的调整提供了依据。

综上所述，这项研究成功构建了一个集抗菌、抗炎、促进组织再生和实时分子监测于一体的多功能水凝胶平台，为糖尿病伤口的精准管理开辟了新途径。

关键技术方法

1. 1.
   水凝胶制备：采用溶液混合法，将20%（w/w）的Pluronic F-127（PF）与不同浓度（1%、2%、3%）的单宁酸（TA）粉末在低温下均匀混合，制备得到温敏性PF/TA水凝胶。
2. 2.
   植物提取物制备与分析：分别通过超声波辅助乙醇提取法和甲醇提取法制备葎草（HS）和葡萄（VV）提取物。利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）鉴定其生理活性化合物，并通过DPPH自由基清除实验评估其抗氧化活性。
3. 3.
   纳米传感器合成：采用硫醇化识别序列与Cy3/Cy5荧光标记的报告序列互补配对后，修饰至金纳米颗粒表面，合成了针对Col1a1、Pecam1和Gapdh mRNA的NanoFlares（NFs）。
4. 4.
   复合水凝胶构建：将合成的NFs溶液和HS或VV提取物加入到2% PF/TA水凝胶中，充分混合得到最终的复合功能水凝胶。

研究结果

2.1 PF/TA温敏水凝胶的制备

研究人员通过将20%的PF与不同浓度的TA（1%、2%、3%）混合，成功制备了PF/TA温敏水凝胶。TA的加入不仅稳定了水凝胶的网络结构，还为其带来了生物活性。

2.2 PF/TA水凝胶的体外抗菌评价

以铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌为模型，通过活死染色和抑菌圈实验评估了PF/TA水凝胶的抗菌活性。结果表明，含有TA的水凝胶表现出显著的抗菌效果，且抗菌活性随TA浓度增加而增强。

2.3 PF/TA水凝胶的体外细胞毒性评价

通过CCK-8试剂盒评估了水凝胶对NIH3T3成纤维细胞的细胞毒性。结果显示，PF/TA水凝胶具有良好的细胞相容性，在6小时和24小时的培养时间内未表现出明显细胞毒性。

2.4 & 2.5 植物提取物的制备

通过超声辅助提取法，分别从葎草（HS）和葡萄（VV）中获得了提取物，为后续的抗炎和促愈合实验提供了原料。

2.6 UPLC-Q-TOF/MS成分分析

利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术分析了HS和VV提取物中的主要生理活性化合物，为理解其生物活性提供了化学基础。

2.7 DPPH自由基清除实验

DPPH实验证实，HS和VV提取物均具有较强的抗氧化活性，这与其富含的多酚类化合物有关，有助于缓解伤口部位的氧化应激。

2.8 细胞培养

研究人员培养了RAW 264.7巨噬细胞、THP-1单核细胞和NIH3T3成纤维细胞，为后续的体外细胞实验奠定了基础。

2.9 NanoFlares的合成与表征

成功合成了针对Col1a1-Cy3、Pecam1-Cy3和Gapdh-Cy5的NanoFlares。动态光散射（DLS）表征显示其具有合适的粒径和zeta电位。特异性实验证明，NFs能特异性地识别并结合目标mRNA序列，释放荧光信号。

2.10 体外增殖与划痕实验

CCK-8实验显示，HS和VV提取物在一定浓度范围内对RAW 264.7巨噬细胞无显著毒性。划痕实验结果表明，这两种提取物均能促进NIH3T3成纤维细胞的迁移，显示出促进伤口闭合的潜力。

2.11 qPCR定量分析

通过qPCR技术检测发现，经HS和VV提取物处理后，成纤维细胞中Col1a1 mRNA的表达水平发生变化，表明其可能影响胶原蛋白的合成与沉积。

2.12 M1巨噬细胞极化实验

在LPS诱导的RAW 264.7和THP-1细胞M1极化模型中，预先给予HS或VV提取物处理，能够显著抑制M1型标志物的表达，并在THP-1细胞中观察到M2型标志物CD206的表达增加。这表明两种提取物具有调节巨噬细胞极化、减轻炎症的潜力。

2.13 复合水凝胶的制备

研究人员成功将NFs和HS/VV提取物整合进PF/TA水凝胶中，形成了最终的复合功能平台。

2.14 水凝胶溶胀率测定

溶胀实验表明，所有水凝胶均具有良好的吸水膨胀性能，这有利于吸收伤口渗出液并维持湿润的愈合环境。

总结与讨论

本研究成功构建了一个基于PF/TA的温敏水凝胶多功能平台，通过整合植物提取物（HS和VV）和DNA修饰的金纳米颗粒mRNA纳米传感器（NFs），实现了对糖尿病伤口的有效治疗和分子水平的实时监测。该水凝胶利用TA的天然特性提供了抗菌、抗氧化和抗炎功能，解决了传统抗生素耐药性问题。植物提取物的引入进一步促进了巨噬细胞从促炎M1型向抗炎M2型的转化，改善了伤口处的炎症微环境。同时，NFs的集成使得研究人员能够通过荧光信号非侵入性地追踪Col1a1（胶原沉积）、Pecam1（炎症）等关键生物标志物的动态变化，为评估伤口愈合阶段和指导个性化治疗提供了有力工具。

研究结论：研究人员开发的PF/TA温敏水凝胶作为一种多功能平台，不仅能够通过其固有的抗菌活性和负载的植物提取物协同促进糖尿病伤口愈合，还能通过集成的纳米传感器实现愈合过程的分子水平监测。该研究为糖尿病伤口及其他慢性伤口的精准管理提供了一个兼具治疗与诊断功能的新策略。