结构依赖性环糊精（Cyclodextrins, CDs）细胞毒性：从急性膜破坏到内体运输（endosomal transport）与脂质分选紊乱

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Disruption of endosomal transport in cyclodextrin-mediated cytotoxicity

　　

环糊精（Cyclodextrins, CDs）在肾上皮细胞中诱导结构依赖性细胞毒性。α-环糊精（α-CD）在尖锐浓度阈值以上引起快速膜破坏，而在阈值以下未观察到亚致死效应。甲基化β-环糊精（Meβ-CD）和γ-环糊精（γ-CD）均增强胆固醇再分布，而未观察到胆固醇耗竭或伴随毒性。Meβ-CD在亚致死浓度下阻滞膜脂内化，并在慢性暴露下抑制增殖。增殖缺陷在天然β-CD中发生，但在羟丙基β-环糊精（HPβ-CD）中不发生，提示边缘取代（rim substitution）参与其中。

论文解读：该研究围绕环糊精（Cyclodextrins, CDs）在肾上皮细胞中的细胞毒性机制展开。CDs作为药物辅料可通过主客体包合增溶疏水药物，但全身应用受非特异性膜相互作用和细胞毒性限制。既往安全评价主要关注β-CD及其衍生物从质膜提取胆固醇、破坏膜筏结构，但不同同系物毒性差异提示胆固醇提取不足以解释生物效应。α-CD因腔径过小不能包合胆固醇，其毒性被联系到膜磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine, PC）提取。CDs经系统暴露后在肾清除过程中蓄积，动物研究显示肾毒性，但不同主体大环的急慢性机制仍不清楚。人近端小管上皮细胞系（RPTEC/TERT1）依赖膜周转、受体介导摄取和囊泡运输，是研究该问题的模型。研究人员比较三种天然同系物与三种β-CD变体，检验胆固醇提取是否足以解释CD细胞毒性，以及是否有其他过程参与，并评估脂质分选和磷脂酰肌醇处理是否与急性膜损伤可分离。

关键技术方法概括：研究使用人近端小管上皮细胞系RPTEC/TERT1，未涉及临床样本队列。主要技术包括刃天青（resazurin）代谢活力检测和流式细胞术（flow cytometry）计数脱落细胞；相差显微镜（phase-contrast microscopy）动态观察形态与细胞数；双染料通透性实验评估膜通透性；BODIPY-胆固醇（BODIPY-cholesterol）报告胆固醇摄取；CellMask Orange追踪内吞性膜脂内化；流式细胞术分析亚细胞颗粒及脂质/胆固醇负载；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI）分析培养上清脂质组成；长期暴露监测增殖。

2.1 初始筛选识别出上皮反应的不同浓度范围：12 h暴露后，0.05–30.0 mg mL^?1 CDs中，代谢变化仅见于30 mg mL^?1；Meβ-CD和γ-CD高浓度代谢短暂升高，γ-CD未显示明显毒性。α-CD或Meβ-CD在3.0–10.0 mg mL^?1增加脱落/死亡细胞，呈S形；α-CD的EC₅₀约3.0 mg mL^?1，较Meβ-CD约30.0 mg mL^?1低10倍，并在测试范围饱和。

2.2 膜破坏反映宿主依赖的上皮损伤：相差成像显示α-CD >10 mg mL^?1在3 h内完全细胞失败，膜完整性丧失并脱落，类似去垢剂；<7 mg mL^?1与对照不可区分。Meβ-CD引起逐步线性细胞数下降和凋亡性膜塌陷，提示应激驱动。

2.3 Meβ-CD暴露增加细胞膜通透性：双染料实验显示α-CD 30 mg mL^?1后3–6 h出现继发性膜通透；Meβ-CD在12 h内通透性逐步线性增加，且在10 mg mL^?1即出现，低于代谢下降和细胞计数变化，提示通透先于死亡。

2.4 较大β-和γ-CD主体加速胆固醇摄取：BODIPY-胆固醇追踪显示胆固醇由膜向胞质puncta内化，初始/最终发射强度与对照相当，未见提取性丢失。半摄取时间分析表明0.5 mg mL^?1 CDs即使表观转运速率加倍；γ-CD效应强于Meβ-CD，且不依赖BODIPY强度。Meβ-CD >7.0 mg mL^?1时摄取速率下降，与毒性/膜通透限制一致。

2.5 亚致死甲基-β-环糊精暴露选择性损害脂质内化：CellMask Orange追踪内吞性膜脂内化。α-CD 0.5–10 mg mL^?1终点面积升高，γ-CD >3.0 mg mL^?1略降；Meβ-CD所有测试浓度显著降低胞质puncta面积且无明显剂量依赖，时间上约4–5 h突然停止，提示内体摄取受损与应激/毒性相关。

2.6 环糊精暴露改变囊泡脂质组成：流式细胞术分离亚细胞事件。α-CD亚细胞颗粒释放与游离细胞数相关，符合碎片/凋亡体。γ-CD和Meβ-CD呈几乎相同的小颗粒剂量反应，因γ-CD无细胞毒性，提示细胞外囊泡（extracellular vesicles, EV）释放增加而非死亡碎片。CellMask Orange发射随γ-和Meβ-CD浓度降低，Meβ-CD尤其显著；低浓度Meβ-CD上清BODIPY-胆固醇发射升高，提示EV胆固醇负载增加。

2.7 上清MALDI分析揭示组成差异：1.0 mg mL^?1 CD处理后，上清谱以膜来源脂质为主，包括神经酰胺（ceramides, CER）、胆固醇酯（cholesterol esters, CE）和二酰甘油（diacylglycerides, DG）。多数高质荷比物种（1000–15,000 Da）为携带单个碱金属阳离子（Na⁺或K⁺）的同二聚体加合物。对照含CDP-二酰甘油（CDP-diacylglycerides, CDP-DGs）6.1%、磷脂酰肌醇（phosphoinositides, PIPs）7.0%、CE 30.0%、CER 14.4%；α-CD仍有CDP-DG 17.8%、PIP 10.4%和DG 21.6%。Meβ-CD上清转向中性脂质，CE 44.5%、CER 22.0%、DG 31.0%，CDP-DG 0.2%、磷脂酸（phosphatidic acid, PA）和PIP显著降低或缺失；γ-CD类似，CE 49.0%、CER 20.0%、DG 24.3%，CDP-DG 0.3%、PIP 0.3%。细胞裂解物中PIP和CDP-DG仍丰富，说明耗竭特异于释放组分。

2.8 细胞生长受损提示非汇合培养中能量或营养功能障碍：非汇合RPTEC/TERT1持续暴露5.0 mg mL^?1 CDs 144 h。对照呈双相生长；α-、γ-、HPβ-CD生长阶段计数超过对照，γ-CD后期下降更陡。Meβ-CD或天然β-CD初始72 h增殖显著受抑，并出现细胞伸长和极化形态，144 h仍少于对照；HPβ-CD无此长期毒性，提示边缘取代决定该反应。

讨论部分：3.1 胆固醇摄取增强但非细胞毒性原因：BODIPY-胆固醇显示CDs未引起提取性丢失，而加速摄取；γ-CD效应更强却无毒性，Meβ-CD在低于毒性浓度即加速摄取，说明胆固醇动员与膜毒性解耦，仅以胆固醇包合能力评估安全性不足。3.2 膜脂内化和囊泡负载改变独立于Meβ-CD毒性：CellMask Orange显示Meβ-CD在所有浓度降低内吞性脂质内化，约4–5 h突然停止，且与毒性、胆固醇内化解耦；γ-CD和Meβ-CD释放相同数量亚细胞颗粒，但Meβ-CD降低CellMask Orange负载。内吞破坏可能是慢性暴露毒性基础；亚致死Meβ-CD 144 h抑制增殖，天然β-CD同样，而HPβ-CD无，说明边缘功能化决定反应。3.3 细胞外脂质组成变化伴随内吞摄取丧失：MALDI显示Meβ-和γ-CD上清中PIPs和CDP-DGs耗竭，中性脂质富集；因PIPs和CDP-DGs参与内体成熟、膜曲率和囊泡形成，这与内吞摄取丧失一致，但精确因果未定，需直接测胞内磷脂酰肌醇池。3.4 急性α-CD毒性与膜增溶一致：α-CD呈尖锐阈值，>10 mg mL^?1 3 h内细胞失败，<3 mg mL^?1基本不受影响；脱落EC₅₀约3.0 mg mL^?1而代谢至30 mg mL^?1仍无EC₅₀，提示膜损伤而非渐进代谢下降。α-CD无亚致死效应，内吞和增殖与对照相近或更高，其毒性局限于高浓度表面活性剂样膜增溶。

研究结论翻译：环糊精广泛用于改善药物溶解度，但其全身应用仍受限于对其生物活性及相关毒性的理解不完整。本研究结果证实，在RPTEC/TERT1培养中，CD诱导的细胞毒性具有强结构依赖性，并通过不同的宿主特异性细胞膜相互作用产生。与先前报道一致，α-CD和Meβ-CD在高浓度诱导膜破坏，符合膜组分增溶。Meβ-CD和γ-CD还通过调节内源性细胞运输增强胆固醇摄取，其中γ-CD作用更强，但在本分析中未显示细胞毒性，表明胆固醇动员和膜毒性解耦。

除急性效应外，本研究识别出Meβ-CD的一种独特亚致死生物活性。在非致死浓度下，Meβ-CD阻滞膜脂内化，并在长期暴露下抑制增殖，揭示一种独立于膜通透化的慢性反应。天然β-CD产生相同增殖缺陷，而羟丙基衍生物不产生，表明边缘功能化而非β支架本身决定宿主是否引发该效应。Meβ-和γ-CD处理培养上清中PIPs和CDP-DGs耗竭，这种组成变化与内体脂质组织改变一致。然而，仍需进一步研究潜在胞内磷脂酰肌醇池破坏，以更好阐明CD生物活性。

总之，这些发现确立脂质运输和囊泡生物发生是CD诱导肾上皮细胞反应中此前未被充分认识的决定因素，这些过程尤其重要，因为近端小管细胞依赖严格调控的膜周转。该框架超越将急性膜破坏和胆固醇提取作为理解CD毒性的主要视角，并强调脂质分选和膜相关信号是未来机制研究的关键靶点。最终，这些结果强调大环结构而非胆固醇亲和力决定慢性细胞毒性潜力，并应为更安全的环糊精治疗系统的理性设计提供信息。