基于双标记平均Ct值逻辑回归的真鲷（Pagrus major）韩国与日本参考群体归属：整合SNP001与SNP008的等位基因特异性qPCR（AS-qPCR）统计分类器

《Fishes》：Integration of Two Allele-Specific qPCR SNP Markers for Assigning Red Seabream (Pagrus major) to Korean and Japanese Reference Groups

对先前报道的用于真鲷（Pagrus major）参考群体归属的等位基因特异性qPCR（AS-qPCR）数据集进行再分析，以开发双标记统计分类器。使用逻辑回归整合来自韩国和日本参考样本的两个先前选定标记SNP001和SNP008的平均循环阈值（Ct）值，并通过受试者工作特征（ROC）曲线分析、基于Youden指数的截断值优化、混淆矩阵分析和重复分层10折交叉验证评估模型性能。单标记分析得出SNP001和SNP008的曲线下面积（AUC）分别为0.869和0.891，而双SNP逻辑模型显示AUC为0.943。在最佳P(Korea)截断值0.387处，模型在模型开发数据集中实现了87.08%的准确度、韩国参考组92.22%的灵敏度和日本参考组81.82%的特异度。通过重复分层10折交叉验证进行的内部验证得到平均AUC为0.9396 ± 0.0580。在一个小型单独收集的市场来源确认集中，20个样本中有18个可评估，准确度为72.22%，灵敏度为77.78%，特异度为66.67%，均相对于购买国标签计算。加入Ct标准差或变异系数未改善交叉验证区分度。这些结果支持一种简约的基于双标记平均Ct的参考组归属框架，同时表明在常规应用前需要使用来源验证的独立样本进行进一步验证。

真鲷（Pagrus major）是东亚地区广泛消费的经济重要海洋鱼类。在韩国，国内和进口真鲷通过相似的海鲜市场分销，地理起源错标会削弱消费者信心、公平贸易和监管执行。由于外部形态、市场标签和分销记录在收获和分销后并不总能充分验证起源，因此需要客观分析方法用于海产品真实性鉴定。DNA方法尤其有用，因为遗传标记相对稳定，并可提供样本水平证据以区分群体或地理来源。先前研究已利用基因分型测序数据选择的单核苷酸多态性（SNP）标记，开发了区分韩国和日本真鲷的定量聚合酶链反应（qPCR）方法，并选定两个等位基因特异性qPCR（AS-qPCR）标记SNP001和SNP008。原研究使用高斯混合模型建立标记特异性分类阈值，并分别独立应用每个标记。报告显示，SNP001总体准确度、灵敏度和特异度分别为81.67%、87.78%和75.56%，SNP008分别为77.78%、74.44%和81.11%。这些结果表明AS-qPCR具有实际适用性，但也显示单个标记不能完全区分。单标记Ct阈值操作简单，但未充分利用多个qPCR标记的联合信息。SNP001和SNP008在韩国和日本样本间呈不同方向模式，提示两者可能提供互补区分信号。多变量统计模型可将这些信号整合为单一概率评分，可能优于独立标记决策。逻辑回归尤其适合，因为它能由连续预测变量提供可解释的类别归属概率。ROC曲线分析和基于Youden指数的截断优化可用于定义实用参考群体归属的概率阈值。因此，研究人员旨在再分析先前生成的SNP001和SNP008 qPCR Ct数据集，并开发双标记逻辑回归模型，将真鲷归属到韩国和日本参考组。单标记ROC性能与联合逻辑回归模型进行比较，并使用Youden指数优化的概率截断、混淆矩阵分析和重复分层10折交叉验证进一步评估分类性能。此外，研究人员检查纳入Ct标准差（SD）或变异系数（CV）的模型，以确定qPCR重复间技术变异是否贡献额外区分信息。该研究提供了先前开发的AS-qPCR检测的统计扩展，并提出一种紧凑的基于双SNP平均Ct的框架，用于将真鲷样本归属到韩国和日本参考组。

研究人员开展的核心工作是再分析先前AS-qPCR检测生成的qPCR Ct数据。开发数据集由180个真鲷样本组成，包括90个韩国样本和90个日本样本；韩国参考样本来自浦项（Pohang）、统营（Tongyeong）和釜山（Busan），日本参考样本来自日本尾鹫市（Owase City）。研究使用SNP001和SNP008两个标记，将韩国定义为阳性类，使模型概率表示P(Korea)。主要技术方法可概括为：以样本水平平均Ct为预测变量，构建非惩罚逻辑回归模型；采用ROC曲线、Youden指数优化概率截断、混淆矩阵及重复分层10折交叉验证评估性能；比较平均Ct、平均Ct加Ct SD、平均Ct加Ct CV三种特征集；并利用20个单独收集的市场来源样本进行确认实验，其中10个购自韩国马山（Masan），10个购自日本松山（Matsuyama），以购买国标签为参考标签。该概括不超过250字。

研究结果如下。

3.1 SNP001和SNP008的单标记归属性能。通过ROC曲线分析，使用全部可用数据分别评估两个标记。SNP001平均Ct较高与归属韩国参考组相关，其AUC为0.869，95%置信区间（CI）为0.813–0.920；SNP008平均Ct较低与归属韩国参考组相关，其AUC为0.891，95% CI为0.840–0.937。最佳单标记截断显示，SNP001平均Ct大于或等于28.579的样本归属韩国参考组，而SNP008平均Ct小于或等于31.442的样本归属韩国参考组。两者方向相反，表明SNP001和SNP008提供互补信号。为直接比较，使用178个完整病例样本重新计算，SNP001的AUC为0.869（95% CI，0.814–0.921），SNP008为0.891（95% CI，0.840–0.937），双SNP逻辑模型为0.943（95% CI，0.914–0.972）。原研究使用高斯混合模型，其性能估计与本研究方法特异，不应直接互换。无论哪种标记单独均未实现韩国和日本样本的完全分离，支持需要多标记分类方法。

3.2 双SNP逻辑回归模型和基于ROC的截断优化。为整合两个qPCR标记，研究人员以SNP001和SNP008平均Ct为连续预测变量构建逻辑回归模型。拟合模型为：logit[P(Korea)] = ?3.583809 + 0.654457(SNP001 mean Ct) ? 0.487187(SNP008 mean Ct)。因此，归属韩国参考组的预测概率为：P(Korea) = 1/[1 + exp(?(?3.583809 + 0.654457X_SNP001 ? 0.487187X_SNP008))]。SNP001正系数表示较高SNP001平均Ct增加P(Korea)，SNP008负系数表示较高SNP008平均Ct降低P(Korea)，与单标记ROC结果一致。双SNP逻辑回归模型AUC为0.943（95% CI，0.914–0.972），高于单标记完整病例AUC。最佳概率截断由Youden指数确定为P(Korea)=0.3869，低于默认0.5。P(Korea)大于或等于0.3869的样本归属韩国参考组，低于该值则归属日本参考组。该截断来自模型开发数据集，应解释为数据集特异性决策阈值，需在额外独立来源样本中评估。基于该截断的逻辑决策边界显示，SNP001和SNP008平均Ct值被联合用于归属，比单标记解释提供更有信息量的分类规则。

3.3 分类性能和交叉验证。使用P(Korea)=0.3869截断，混淆矩阵显示90个韩国样本中83个正确分类，88个日本样本中72个正确分类；7个韩国样本被归为日本参考组，16个日本样本被归为韩国参考组。模型表观准确度为87.08%（95% CI，81.36–91.23%），灵敏度为92.22%（95% CI，84.81–96.18%），特异度为81.82%（95% CI，72.49–88.49%）。由于模型拟合和截断优化均使用模型开发数据集，这些值为表观分类性能。重复分层10折交叉验证的平均AUC为0.9396 ± 0.0580，接近全数据AUC 0.943；平均准确度、灵敏度和特异度分别为84.25 ± 8.54%、85.44 ± 13.94%和82.99 ± 12.13%。校准评估显示交叉验证Brier分数为0.1014，校准图在部分中间概率范围偏离完美校准，提示预测概率作为绝对概率估计应谨慎解释。该内部验证以两个预指定SNP标记为条件，未重复原AS-qPCR研究中的标记选择过程。

3.4 Ct变异性评估和市场来源确认。比较平均Ct、平均Ct加Ct SD、平均Ct加Ct CV三种特征集，平均Ct模型的平均交叉验证AUC为0.9396 ± 0.0580，平均Ct加Ct SD为0.9336 ± 0.0595，平均Ct加Ct CV为0.9303 ± 0.0613；平均Ct模型最高，加入Ct SD或CV未改善区分度，支持使用更简单的平均Ct逻辑回归模型。市场来源确认实验使用20个未纳入开发数据集的样本，其中10个购自韩国马山，10个购自日本松山；因无法获得农场、供应商或可追溯性文件确认个体地理起源，购买国标签被用作参考标签。固定逻辑回归方程和P(Korea)=0.3869截断未重新训练或重新优化。18个样本获得完整双标记平均Ct数据，可评估率为90.00%（95% CI，69.90–97.21%），其中13个正确归属。可评估样本准确度为72.22%（95% CI，49.13–87.50%），对购买国标签为韩国的样本灵敏度为77.78%（95% CI，45.26–93.68%），对购买国标签为日本的样本特异度为66.67%（95% CI，35.42–87.94%）。总体正确归属产出为65.00%（13/20；95% CI，43.29–81.88%）。两个样本因缺乏有效SNP008平均Ct数据不可评估。该确认集性能低于开发数据和交叉验证结果，置信区间较宽，提示将固定模型应用于单独收集样本时分类性能可能变化。由于参考标签基于购买国而非独立验证的地理起源，观察性能应解释为与购买国标签的一致性，而非已验证地理起源准确度。

讨论部分总结：原文指出，市场来源确认结果与模型开发及交叉验证结果之间的差异表明，内部区分不一定直接转化到单独收集样本。该差异可能反映生物异质性、采样差异或检测水平变异，这些未在开发数据集中充分体现。平均Ct值是定量检测测量，批间或其他分析条件差异也可能影响概率估计，应在未来多批次和多地点验证研究中评估。因此，当前双SNP模型应视为紧凑的参考组归属框架，而非确定性地理起源诊断检测。P(Korea)=0.3869截断在开发数据集内优化，不应视为普遍可转移阈值，其操作特性可能随群体组成和检测条件变化。尽管未重新训练或重新优化便应用于市场来源确认样本，常规应用前仍需使用来源验证样本进行更广泛验证。

研究结论翻译：总体而言，双SNP逻辑回归模型提供了一种紧凑且可解释的方法，用于整合SNP001和SNP008平均Ct值，以将真鲷归属到韩国和日本参考组。当使用相同的178个完整病例样本评估时，组合模型比任一单标记模型显示出更高的区分性能，而纳入Ct SD或Ct CV并未改善交叉验证性能。重复分层交叉验证支持该模型的内部区分性能，而在小型单独收集的市场来源确认集中观察到的较低准确度、其较宽的置信区间以及两个不可评估样本，突出表明需要在具有独立验证来源的额外样本中进一步评估。由于确认参考标签基于购买国而非经验证的地理起源，确认结果不应解释为对地理起源准确性的验证。这些发现表明，经ROC优化的逻辑建模为整合AS-qPCR标记信息提供了一种实用的基于概率的框架，尽管该模型及其数据集衍生概率截断值在常规实施前需要使用来源验证样本在额外人群和检测条件下进行更广泛验证。