通过核磁共振波谱法监测天然折叠蛋白质转变为淀粉样纤维的淀粉样蛋白形成过程

《Biophysical Chemistry》：Monitoring amyloid formation from natively folded proteins to amyloid fibrils by NMR spectroscopy

　　

# 摘要

淀粉样蛋白是通过蛋白质错误折叠形成的不溶性蛋白质聚集体，与多种神经退行性疾病、系统性淀粉样变性及其他人类疾病相关。核磁共振（NMR）光谱学，包括溶液态和固态方法，具有独特优势，能够研究复杂的淀粉样蛋白形成途径的每个阶段，从可溶性单体前体，经过瞬态中间状态和低聚物组装，直至高度有序的成熟纤维。这种残基特异性和原子水平的聚集过程表征，使用其他生物物理技术难以实现。

NMR特别适合阐明淀粉样蛋白形成的机制，因为它能够在分子分辨率下提供多种聚集状态的详细结构和动态信息。本综述重点介绍了溶液态和固态NMR方法在表征天然折叠的淀粉样蛋白原蛋白转化为淀粉样纤维过程中的应用，特别强调了对瞬态中间体的鉴定和表征，包括可观测和"不可见"物种、高分子量低聚物以及不溶性纤维聚集体。文中讨论了天然折叠的淀粉样蛋白原前体蛋白的代表性实例，并对用于阐明其错误折叠和聚集机制的NMR方法进行了概述。总体而言，这些研究展示了NMR光谱学在残基水平分辨率下为淀粉样蛋白形成提供机制和结构见解的强大能力。

# 引言

淀粉样蛋白（Amyloids）一词源自拉丁语"amylum"，指由于蛋白质错误折叠而形成不溶性纤维结构的蛋白质聚集体。淀粉样变性是一组疾病的总称，其特征是正常可溶性前体蛋白转化为纤维状淀粉样沉积物[1]、[2]。超过50种人类疾病与淀粉样蛋白形成有关。尽管涉及的具体前体蛋白不同，蛋白质错误折叠是这些疾病的共同标志。这些前体可能包括与神经退行性疾病相关的固有无序蛋白（IDPs），如淀粉样蛋白-β（amyloid-β）和α-突触核蛋白（α-synuclein），朊病毒蛋白（PrP），以及与透析相关淀粉样变性相关的天然折叠蛋白，如β2-微球蛋白，与遗传性系统性淀粉样变性相关的转甲状腺素蛋白（TTR）、溶菌酶以及免疫球蛋白轻链[2]、[3]、[4]。在本综述中，我们聚焦于天然具有结构的淀粉样蛋白原前体蛋白，并在表1中列出了它们及其相关的淀粉样疾病。

淀粉样蛋白形成是一个多步骤过程，其中可溶性蛋白（无论是展开还是折叠状态）通过部分折叠的中间体或高分子量低聚物种聚集并转化为不溶性、有序的纤维[3]。荧光染料硫黄素T（Thioflavin T, ThT）被广泛用于识别和监测淀粉样纤维化途径以及蛋白质聚集，无论是在体外还是体内[5]、[6]。它特异性地与淀粉样纤维特有的交叉β折叠片结构结合，从而增强荧光信号[7]、[8]。这使得能够实时追踪聚集动力学，通常产生一条S形曲线。该曲线具有三个不同的阶段：滞后期/成核期、增长（延伸）期和最终的平台期（稳定期）。成核事件在此发生，从单体蛋白开始。天然的折叠单体蛋白具有一个容易聚集的区域，该区域会发生构象变化至部分展开状态，这通常会触发淀粉样蛋白形成。随后出现高分子量物种，即低聚物，它们是单体的重复单元。通过改变曲线，可以探测聚集动力学中的分子事件，包括纤维形成过程中的初级成核和次级成核[9]、[10]、[11]（图1）。这些聚集动力学和机制因蛋白质序列、淀粉样蛋白原构象以及温度、pH、蛋白质浓度和溶剂等环境或实验因素而异。尽管ThT检测，特别是与透射电子显微镜（TEM）以及其他生物物理技术如动态光散射（DLS）和分析离心等技术相结合，能够为纤维化动力学和物种大小提供宝贵的见解，但它们在残基或原子水平的结构细节和分子机制方面提供的信息有限。

X射线晶体学和冷冻电子显微镜（cryo-EM）为淀粉样纤维的结构组织提供了重要见解。早期的X射线纤维衍射建立了淀粉样纤维特有的交叉β结构[7]、[8]、[12]、[13]、[14]、[15]，而晶体学研究揭示了稳定淀粉样组装的立体拉链相互作用。冷冻电镜进一步使阐明成熟淀粉样纤维的形态和接近原子分辨率的结构成为可能[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。然而，尽管这些技术对理解淀粉样纤维的结构组织做出了贡献，但它们对淀粉样聚集过程中形成的瞬态早期中间体和低聚物种提供的见解有限。核磁共振（NMR）光谱学提供了一种互补方法，通过提供蛋白质结构、构象动态和分子相互作用在不同淀粉样形成阶段的残基特异性信息。溶液态NMR能够研究可溶性单体、部分展开构象和瞬态低聚物种，而固态NMR则为成熟淀粉样纤维提供原子水平的结构见解。这些互补方法共同提供了对淀粉样蛋白形成的分子机制的全面理解，从天然蛋白的初始构象变化到高度有序纤维的组装[26]。

淀粉样蛋白聚集体可由以下类型的蛋白质形成：(a) 固有无序蛋白（IDPs），如淀粉样蛋白-β（Aβ）、α-突触核蛋白和胰岛相关多肽（IAPP）；(b) 具有固有无序区域（IDRs）的结构化但热力学或动力学上不稳定的蛋白质，如免疫球蛋白轻链变体、血清淀粉样蛋白A（SAA）、转甲状腺素蛋白（TTR）和β2-微球蛋白；(c) 同时具有结构区和固有无序区域的蛋白质，如朊病毒蛋白和含多聚谷氨酰胺的蛋白质，如脊髓小脑共济失调蛋白3（Ataxin 3）和亨廷顿蛋白（huntingtin）[3]。

淀粉样蛋白形成通常与发病机制相关；然而，已知的淀粉样纤维被称为功能性淀粉样蛋白，也可在生理过程中发挥进化保守的、非毒性的生物学作用[27]、[28]、[29]。功能性淀粉样蛋白，如疏水蛋白[30]、CsgA[31]、Het-S[32]、Sup-35[33]和β-内啡肽[34]、[35]，其结构已在原子分辨率下得到充分表征，通过固态NMR光谱学为它们的分子结构、构象动态、分子间相互作用和功能性淀粉样蛋白形成机制提供了见解[36]。此外，淀粉样蛋白还可用于制造新型水凝胶，具有热可逆、非毒性和触变性，适用于生物材料应用[37]、[38]、[39]、[40]。

在过去十年中，大量研究表明液-液相分离（LLPS），或涉及膜细胞器的生物分子凝聚体，是聚集途径中的一个关键步骤[41]、[42]。这种转化特别在固有无序蛋白（IDPs）如α-突触核蛋白[41]、[43]、[44]、tau蛋白[45]、[46]以及具有低复杂度或朊病毒样结构域的蛋白质，特别是RNA结合蛋白中观察到[47]。与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTLD）相关的蛋白质，如TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）[48]、融合于肉瘤蛋白（FUS）[49]、[50]、[51]、异质核糖核蛋白A1/A2（hnRNPA1）[52]、[53]，以及与帕金森病相关的α-突触核蛋白[55]，在适当条件下表现出可逆的相分离。这些凝聚体或液滴可成熟为富含β折叠片的不可逆凝胶状或类固体纤维结构，可能导致病理性纤维。LLPS主要由多价弱相互作用驱动，包括蛋白质-蛋白质和蛋白质-RNA相互作用[49]、[56]、[57]。最近，许多NMR研究和方法被开发出来以理解从液滴到纤维聚集体的转变。使用固态NMR和分段标记技术，研究人员确定了FUS纤维的刚性核心，并发现其缺乏疏水核心，这使其与病理性纤维不同[58]。Fawzi及其同事使用溶液态NMR表征了FUS低复杂度结构域液相的结构和分子运动[59]以及RNA结合蛋白TDP-43[60]。最近，一种名为REDIFINE（LLPS REstricted DIFusion of Invisible speciES）的非侵入性、无标记技术被开发出来以表征生物分子凝聚体[61]。

多年来，NMR光谱学在揭示淀粉样蛋白形成中涉及的初始分子事件及其详细原子结构方面发挥了重要作用[62]。溶液态NMR特别适合研究小的、水溶性蛋白质物种，如单体、低丰度的部分折叠中间体、不可见的早期低聚物，这些物种在聚集的初始成核前阶段占主导地位，并以溶液中快速的分子动态为特征[63]、[64]、[65]、[66]、[67]、[68]；而固态NMR则用于阐明成熟、不溶性纤维的原子水平结构，这些纤维是聚集过程的最终阶段[69]、[70]、[71]、[72]、[73]、[74]。为了简化错误折叠过程中结构转变的复杂性，Ehud及其同事使用金属离子/二肽混合物表明，结构转变从β折叠片进行到超螺旋或无规卷曲[75]。

在本文中，我们回顾了NMR对理解淀粉样蛋白形成的贡献。许多过去的综述和研究专注于使用NMR技术研究固有无序蛋白的错误折叠[76]、[77]、[78]、[79]、[80]、[81]、[82]，这与许多神经退行性疾病相关[83]。在本综述中，我们聚焦于天然折叠或具有结构形式具有淀粉样蛋白原性的蛋白质，并提供简要概述了针对这一应用的蛋白质NMR方法[84]、[85]。我们按照ThT检测动力学中观察到的物种，讨论了溶液态和固态NMR如何表征它们。本综述分为三个部分：(1) 使用溶液态NMR光谱学方法，如实时NMR、化学位移分析、弛豫测量、氢氘（HD）交换，来表征天然状态的构象动态、早期瞬态物种和易聚集状态，主要是ThT检测的滞后期。使用DOSY和甲基TROSY实验来表征高分子量低聚物。(2) 使用固态NMR魔角旋转（MAS）方法研究高分子量低聚物和纤维状态，即ThT检测的稳定期或平台期。(3) 用于研究淀粉样蛋白形成的一些高级NMR技术及其展望。

# 章节片段

## 淀粉样蛋白原中间体 - 溶液态NMR

在本节中，我们讨论了用于表征早期事件的溶液态NMR方法，包括部分折叠中间体的形成、可见和不可见中间体，以及淀粉样蛋白形成机制中涉及的瞬态展开状态[87]，如图1所示；我们还讨论了ThT动力学滞后期观察到的物种，并给出了几个示例。这里的示例特别聚焦于天然折叠的淀粉样蛋白原蛋白。表2总结了——

### SedNMR

沉降速度核磁共振（SedNMR）是一种NMR技术，其中高度浓缩的、可溶性的高分子量低聚中间体在具有魔角旋转（MAS）转子的超速离心机中离心[187]。这些高分子量组装体可以在使用MAS测量样品时通过转子旋转产生的离心力直接沉降[179]、[180]。固定的沉降样品包含溶液相和固相；因此，通过——

## 展望

除了理解分子物种的动力学、结构和热力学性质外，获得淀粉样蛋白形成的机制见解也至关重要。尽管其他技术提供了分子事件的见解，但NMR是唯一能够在原子水平表征分子物种的技术，包括短寿命的瞬态可见和不可见状态。超快魔角旋转（MAS）的最新进展使得旋转频率超过110 kHz成为可能——

# CRediT作者贡献声明

Jyoti Singh：撰写——原稿撰写，调查。
Tejaswini Pradhan：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿撰写，调查，概念化。

# 关于生成式AI和AI辅助技术的使用声明

作者确认在撰写过程中使用了生成式AI工具（具体为OpenAI的ChatGPT）来支持语言编辑和文本润色。所有知识内容、科学解释和结论均由作者开发、验证并批准。没有AI工具参与数据分析或科学决策。

# 利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本论文中所报告的工作。

# 致谢

作者感谢德国慕尼黑工业大学自然科学学院生物科学系拜仁NMR中心（BNMRZ），地址：Lichtenbergstr. 4, 85747 Garching, 德国；印度勒克瑙生物医学研究中心；以及印度加济阿巴德科学与创新研究院，邮编201002。

Jyoti Singh | Tejaswini Pradhan
印度勒克瑙SGPGIMS校区医学中心，Raebareli Road，邮编226014