基于卡博铂的双核铂(IV)前药，通过1,6-二氨基己烷连接：设计、合成、还原反应、与DNA的相互作用及其抗肿瘤活性

《Bioorganic Chemistry》：Carboplatin-derived Dinuclear Pt(IV) prodrug linked by 1,6-Diaminohexane: Design, synthesis, reduction chemistry, DNA interaction, and antitumor activity

　　• 合成了一种基于卡铂的双核Pt(IV)前药，其中1,6-二氨基己烷位于轴向位置。• 在体外对人癌细胞和非癌细胞系进行了研究，并确定了细胞死亡的凋亡机制。• 评估了活性氧（ROS）水平、细胞周期数据和Western blot分析结果。• 观察到肿瘤缩小，这支持了其在体内的应用潜力。• 通过光谱监测和分子对接模拟获得了DNA结合亲和力。

引言
癌症被认为是全球主要的死亡原因之一[1]。根据世界卫生组织（WHO）的报告，2022年全球新增癌症病例超过2000万例，因癌症死亡的人数为970万[2]。为了应对这一问题（预计到2050年将增加77%），人们正在积极采用各种癌症治疗方法[3]。除了传统的方法如手术、放疗和化疗外，最近还采用了干细胞疗法、基因疗法、靶向药物治疗、免疫疗法和激素疗法等替代疗法[4]。然而，无论是单独使用还是与放疗、化疗联合使用，化疗仍然是最有效的癌症治疗方法[4],[5]。基于铂的复合物在化疗中起着关键作用[6]。三种基于铂的药物——顺铂、卡铂和奥沙利铂在全球范围内被用于癌症治疗[7]，它们能够形成DNA加合物，干扰复制和转录过程，最终导致细胞死亡[8]。值得一提的是，由于其较低的毒性和增强的疗效，卡铂被用来研究由于配体区域修饰（特别是通过烷基烃二胺的变化）而引起的生物性质的变化[9]。

类似于许多细胞毒性药物，接受顺铂治疗的患者（虽然卡铂和奥沙利铂的影响较小）常常会出现不良副作用，包括肾毒性和耳毒性，这限制了可以使用的剂量。由于顺铂在化疗过程中会在体内引起副作用，因此其使用范围受到限制，以确保安全有效地使用。此外，它不能治疗许多常见癌症，如结肠癌和乳腺癌。然而，顺铂对睾丸癌非常具有细胞毒性且效果显著[10]。另一个挑战是肿瘤可能会对顺铂及其类似的铂类药物产生抗性，癌细胞通过减少药物积累和修复其造成的DNA损伤来抵抗这种临床药物[11]。

具有两个通过配体连接的铂中心的铂双核复合物因其独特的性质和多个应用领域而引起了大量研究[12]。这些铂复合物表现出很强的抗癌活性，并能开发出更有效的抗癌药物。它们通常比单一铂药物对癌细胞更具毒性，因为它们与DNA的相互作用更强，导致更大的DNA损伤和细胞死亡。拥有两个铂中心还有助于它们更有效地结合细胞内的目标。为了设计更有效的铂药物和更安全的类似物，充分了解这些双核复合物在生物条件下的反应方式非常重要[11],[12]。最近，报道了带有轴向乙二醇配体的不对称单核和双核Pt(IV)复合物[13]。这些研究表明，Pt(IV)前药的生物活性受到诸如脂溶性、药物积累、水溶性和轴向配体极性等结构特征的显著影响[13]。

前药是经过修饰的药物形式，在体内会转化为活性药物。它们用于改善药物在体内的生物反应过程。大约5-7%的批准药物是前药，其在药物开发早期的使用正在增加[14]。过去20年里，前药策略成功改善了药物的性能[13],[15]。最近，研究人员关注于与传统设计不同的新型铂药物，包括作为Pt(II)药物前药的单功能Pt(IV)化合物[16]。铂(IV)前药是通过氧化铂(II)药物制成的，它们具有更稳定的结构[17]。它们含有轴向配体，可以改变其性质，例如活化速率和脂溶性，以及它们在体内的移动方式[18],[19]。在细胞内，这些Pt(IV)前药必须被还原为Pt(II)节点才能成为活性的抗癌成分。这种还原作用发生在维生素C和谷胱甘肽等天然还原物质的存在下[20],[21]。另一方面，添加的配体的修饰可以调节Pt(IV)前药的化学和生物学性质，从而提高药物的递送和有效性[22],[23],[24]。

胺类作为带正电的分子，可以稳定像DNA这样的负电分子，并影响细胞内的离子运输[25],[26]。这些化合物还可以与金属离子结合，它们的衍生物显示出重要的生物活性，尤其是在作为金属复合物中的连接单元时[27]。研究人员越来越多地研究生物产生的长碳链胺类，特别是1,6-二氨基己烷，这对制造工业材料非常重要[28],[29]。在生物学上，1,6-二氨基己烷对细胞分化的作用较弱，目前正在进行研究以了解相关复合物如何影响细胞生长和发育。在癌症研究中，科学家还使用长链胺类（如辛胺）来设计新的铂(IV)前药[30]。由于其更大的稳定性、溶解性和有效性，特别是对抗乳腺癌方面，这种策略可以帮助减少副作用[30]。

在这项研究中，我们开发了一种新的策略，通过合成其双核Pt(IV)前药来传递卡铂，该前药包含两个通过不同长度的氨基链连接在一起的卡铂单元，有助于药物更容易进入细胞并与DNA更好地相互作用。因此，设计并合成了一个新的双核Pt(IV)复合物及其中间体（见方案1）。使用FT-IR、UV-Vis、循环伏安法（CV）、HPLC和LC-质谱、CHN分析以及1H NMR、13C NMR和195Pt NMR光谱等技术详细分析了这些铂复合物。最后，通过计算DFT方法描述了结构与生物行为之间的关系。

研究了这种双核Pt(IV)复合物的水解性质，如稳定性、溶解性和脂溶性，并将其与卡铂进行了比较。还通过添加抗坏血酸分析了Pt(IV)复合物的还原速率。DFT分析和计算机建模用于研究其结构和还原过程。利用UV-Vis和圆二色性监测、粘度测量以及分子对接模拟研究了Pt(IV)复合物与DNA的相互作用。此外，还评估了其对人类乳腺癌（MCF-7）和卵巢癌（Skov-3）细胞以及正常细胞（MCF-10A）的抗癌效果，并研究了细胞死亡机制。利用活性氧（ROS）和细胞周期细胞毒性来帮助我们研究和确定细胞死亡。通过细胞内的活性氧（ROS）生成、细胞周期分布、凋亡分析以及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的Western blot分析进一步探讨了细胞死亡的潜在机制。最后，在携带乳腺肿瘤的小鼠模型中评估了最具前景的复合物的体内抗肿瘤效果，以进一步评估其治疗潜力。

材料和物理测量
琥珀酸酐和1,1'-羰基二咪唑（CDI）购自美国的Sigma公司。卡铂（纯度为99.8%，通过HPLC分析确认）按照参考文献[31]中概述的程序获得。1,6-二氨基己烷从德国的Merck公司采购。Tris缓冲液、抗坏血酸和聚合的小牛胸腺DNA也从Sigma-Aldrich公司购买。此外，溶剂DMF和DMSO也从Merck公司购买，使用前进行了干燥。

Pt复合物的表征
所有Pt复合物都是通过方案2中的合成路线制备的。
NMR光谱数据
根据报告，在DMSO-d6中记录的卡铂的1H NMR光谱在1-4 ppm范围内显示信号[31]。当氧化成复合物2（相应的二氢氧Pt(IV)类似物）时，在大约1-1.2 ppm处出现了额外的OH质子信号，而胺质子在DMSO-d6中的共振峰约为5.5 ppm（图S1和表S1）。这些信号在D2O中由于质子交换而消失（图S1）。

结论
在这项研究中，合成了一种高纯度的双核Pt(IV)前药（复合物4），并通过轴向保护和提高Pt活性位点到靶细胞的积累来改良临床使用的卡铂药物。复合物4的结构通过195Pt NMR（峰位于3840 ppm，表明存在对称的两个Pt(IV)离子中心）、LC-MS、13C NMR和FT-IR分析得到确认。DFT研究表明，LUMO轨道（-2.67 eV）主要定位在一个碳原子上。

作者贡献声明
Hosein Keivanshekooh：撰写 - 原稿撰写、可视化、软件使用、方法论设计、实验实施、形式分析。
Mahboube Eslami Moghadam：撰写 - 审阅与编辑、可视化、验证、监督、软件使用、资源管理、项目管理、方法论设计、资金获取、概念构思。
Mitra Ghassemzadeh：撰写 - 审阅与编辑、验证、监督、项目管理。
Saeed Jafarkhani：撰写 - 审阅与编辑、可视化、验证、方法论设计。

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢
作者感谢伊朗化学与化学工程研究中心对本项目的财政支持。

伦理声明
我们确认所有方法均按照相关指南和规定进行。动物实验是在获得德黑兰医科大学伦理委员会批准后进行的。项目期间所有的伦理问题均按照现有协议进行了监督。本研究遵循ARRIVE指南（https://arriveguidelines.org）进行。

动物实验
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。不需要伦理委员会的批准。作者确认所有方法均按照相关指南和规定进行。动物实验是在获得德黑兰医科大学伦理委员会批准后进行的。项目期间所有的伦理问题均按照现有协议进行了监督。