NKG2D过表达通过肿瘤NKG2D配体反式共刺激增强CAR-T细胞抗肿瘤活性并降低NK细胞介导的细胞毒性

《Cell Reports Medicine》：NKG2D overexpression potentiates CAR-T cells through costimulation by tumor NKG2D ligands

　　

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中已取得显著成功，但持久的疗效仍受限于CAR-T细胞持久性不足。在此，研究人员表明，活化的CAR-T细胞上调多种NKG2D配体（NKG2DLs），增加其对自然杀伤（NK）细胞介导的CAR-T细胞细胞毒性的易感性。为应对这一脆弱性，研究人员将CAR-T细胞工程化以过表达全长NKG2D（CAR-NG）。NKG2D过表达降低了内源性NKG2DLs的表面可及性，而不降低其总蛋白丰度。同时，肿瘤表达的NKG2DLs的反式结合提供额外的共刺激信号，增强CAR-T细胞活化和增殖，同时减轻耗竭相关表型。在血液和实体瘤模型中，与常规CAR-T细胞相比，CAR-NG细胞表现出对NK细胞介导的细胞毒性易感性降低、肿瘤控制改善、体内扩增增加、肿瘤浸润更深，且无明显额外毒性。这些发现将NKG2D过表达确定为一种工程策略，主要通过与肿瘤NKG2DL依赖的反式共刺激增强CAR-T抗肿瘤活性。

论文解读：嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中已取得显著成功，但持久疗效仍受限于CAR-T细胞持久性不足。在实体瘤中，疗效进一步受到肿瘤运输差、扩增有限和免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的制约。第二代CAR通过将共刺激域（CSD）整合到胞内区，显著增强T细胞活化和扩增。当前临床产品主要采用CD28或4-1BB（CD137）共刺激域。研究人员探索了替代或附加CSD，如ICOS、OX40和CD27，以及工程化平行/串联多共刺激信号，旨在优化效力和持久性之间的平衡。在体内，宿主免疫细胞包括自然杀伤（NK）细胞可影响CAR-T细胞扩增和存活。活化的CAR-T细胞可上调多种NK细胞活化受体的配体，从而易受NK细胞监视和细胞毒性。其中，MICA/B和ULBP家族成员触发NK细胞活化，限制CAR-T扩增并削弱抗肿瘤疗效。因此，减少CAR-T细胞表面NKG2D配体（NKG2DLs）的可及性可能减轻NK细胞介导的免疫清除并改善持久性。基于顺式结合原理，研究人员提出过表达全长NKG2D的策略，以通过顺式掩蔽减少内源性NKG2DLs的可及性，同时利用肿瘤NKG2DLs的反式结合提供共刺激信号。研究人员开展了系列研究，工程化CAR-T细胞过表达全长NKG2D（CAR-NG），并在血液和实体瘤模型中评估其功能。研究发现，NKG2D过表达主要通过与肿瘤NKG2D配体依赖的反式共刺激增强CAR-T抗肿瘤活性，同时降低内源性NKG2DLs的表面可及性，减少NK细胞介导的细胞毒性。该研究具有重要意义，提出了一种增强CAR-T细胞持久性和抗肿瘤疗效的工程策略。论文发表在《Cell Reports Medicine》。

为开展研究，研究人员使用了来自健康供体的人外周血单个核细胞（PBMCs）和雌性NPG小鼠异种移植模型。人PBMCs购自Oricells，伦理批准号KY2024-022-004；雌性NPG小鼠购自北京维通利华。关键技术方法包括慢病毒转导构建CAR-T细胞、流式细胞术、共聚焦免疫荧光、NanoBiT互补和荧光共振能量转移（FRET）邻近分析、NK细胞杀伤实验、三重共培养、NKG2D-Fc阻断实验、增殖竞争实验、Western blot、RNA测序、多重免疫荧光（mIF）及HALO空间分析。

研究结果：第一，CAR-T细胞活化上调NKG2DLs并增加对NK细胞介导的细胞毒性易感性。通过CD3/CD28刺激或抗原刺激，CAR-T细胞表面MICA/B、ULBP1、ULBP3和ULBP-2/5/6在48-72小时上调。NK细胞共培养导致CAR-T细胞早期凋亡（Annexin V⁺）增加和活细胞减少，重复抗原刺激的CAR-T细胞更易被NK细胞杀伤。第二，过表达NKG2D降低NKG2DLs的可及性。研究人员构建CAR19-NG，流式确认NKG2D过表达。重复抗原刺激后，CAR19-NG表面NKG2DLs的抗体可检测信号显著降低，但总蛋白不变。共聚焦显示NKG2D与MICA/B强共定位，NanoBiT和FRET支持纳米级邻近。体外结合实验显示NK-CAR-T双阳性事件减少，体内PKH67转移减少，支持顺式掩蔽模型。第三，NKG2D过表达减少NK细胞相关CAR-T细胞死亡同时保留肿瘤细胞毒性。与自体NK细胞共培养，CAR19-NG的7-AAD⁺比例更低。三重共培养中，CAR19-NG活细胞恢复增加、7-AAD⁺降低，同时维持肿瘤细胞毒性。该保护作用在CAR-EGFR-NG中也有。在HLA敲除的通用CAR-T中，NKG2D过表达不能完全防止NK细胞毒性，但显著降低NK反应性。NKG2D突变体（CAR19-NGmut）保留屏蔽功能但肿瘤杀伤降低，表明屏蔽和共刺激功能分离。第四，肿瘤表达的NKG2DLs反式结合为CAR-NG细胞提供共刺激。公共数据库分析显示NKG2D表达与免疫细胞活化、招募评分正相关。与常规CAR19相比，CAR19-NG对血液肿瘤和实体瘤（SK-N-SH、A431、A549）细胞毒性更高。NKG2D-Fc阻断肿瘤侧NKG2DLs降低CAR19-NG的额外功能优势，而阻断CAR-T侧配体影响有限。CAR19-NG产生更多TNF-α、IL-2、IFN-γ、穿孔素、颗粒酶B，脱颗粒增强。NKG2D抗体阻断降低杀伤和长期存活。第五，NKG2D过表达增强CAR-T细胞活化并限制耗竭。静息态CAR19-NG的CD69基线低，抗原刺激后CD69⁺活化细胞比例更高，早期凋亡不增加。记忆表型偏向naive/central memory，CD8⁺比例更高。信号分析显示CAR/CD3ζ、ZAP70、PLCγ1磷酸化增强，NF-κB、AP-1、NFAT转录活性升高。重复刺激后扩增和肿瘤裂解维持，耗竭标记PD-1、TIM-3、LAG-3不增加。第六，NKG2D过表达增强CAR-T细胞体内增殖能力和抗肿瘤疗效。Nalm6-luc白血病模型中，CAR19-NG改善肿瘤控制并延长生存。竞争性共移植实验中，CAR19-NG在血中比例约6倍于CAR19。体外染料稀释、Ki-67⁺显示增殖优势。转录组富集TCR信号、Ras-MAPK、PI3K-AKT、细胞因子反应和细胞黏附。蛋白水平p-AKT、p-ERK1/2、p-STAT3增强。第七，NKG2D增强实体瘤中CAR-T细胞活性。A431皮下异种移植模型中，CAR-EGFR-NG快速持续抑制肿瘤，体重稳定，无全身毒性。外周血CD3⁺ CAR-T频率更高。mIF显示CD3⁺ CAR-T浸润密度更高，残余肿瘤细胞减少，Ki-67⁺更高。TME重塑：CD68⁺巨噬细胞和MPO⁺中性粒细胞浸润增加。空间分析显示CAR-T与肿瘤细胞距离缩短，邻接增加，浸润更深更均匀。人CD56⁺ NK细胞在肿瘤中罕见，无法进行NK-CAR-T空间共定位分析。

讨论部分总结：CAR-T疗法在血液肿瘤中取得进展，但实体瘤疗效和长期持久性仍是挑战。限制瓶颈是维持足够数量功能 competent 的CAR-T细胞。研究人员检查了活化的CAR-T细胞上NKG2DLs诱导的潜在机制。提出NKG2D过表达提供两个互补功能：减少CAR-T细胞NKG2DLs可及性（顺式免疫屏蔽），同时实现肿瘤NKG2DL依赖的反式共刺激增强效应功能。多层面证据支持顺式掩蔽模型。功能上，减少配体可及性与免疫屏蔽益处相关。但研究人员认为减少CAR-T侧配体可及性主要是潜在免疫屏蔽机制，而非增强肿瘤杀伤的主要驱动因素。机制分析显示NKG2D过表达不诱导强直信号，但增强近端CAR信号。NKG2D信号域失活突变体保留抗NK细胞毒性但肿瘤杀伤降低，支持共刺激贡献。阻断肿瘤细胞NKG2DLs显著降低靶细胞裂解，表明反式结合肿瘤NKG2DLs主要解释增强的肿瘤杀伤。NKG2D通过DAP10适配器招募PI3K和Grb2-Vav1，稳定免疫突触，间接放大CD3ζ-ZAP70信号。体内血液肿瘤模型中CAR19-NG扩增和肿瘤控制更强。实体瘤中CAR-EGFR-NG促进更深浸润和更有效靶向结合。研究局限包括：在A431异种移植模型中，人NK细胞很少检测到，不支持NK细胞介导的CAR-T清除在实体瘤微环境中的主要作用；NKG2D过表达不能完全保护HLA缺陷细胞；未生成完全NKG2DL缺失肿瘤模型；长期持久性和安全性、分子整合需进一步研究；共定位、NanoBiT和FRET支持膜邻近但未建立直接结构顺式结合；体内评估在免疫缺陷异种移植模型中进行。

研究结论翻译：总之，本研究表明，NKG2D过表达主要通过肿瘤NKG2DL依赖的反式共刺激增强CAR-T细胞功能，从而促进CAR-T细胞活化、增殖、持久性、肿瘤浸润和抗肿瘤疗效。NKG2D过表达还降低了活化CAR-T细胞上内源性NKG2DLs的表面可及性，而不降低其总丰度，符合顺式掩蔽。虽然这种顺式相互作用在共培养实验中与减少NK细胞介导的CAR-T细胞细胞毒性相关，但最好将其视为一种潜在的辅助机制，而非增强抗肿瘤疗效的主要驱动因素。