体外溶剂对伯氏疏螺旋体ATP依赖性代谢活性及细胞计数的影响

《Microbiology Research》：In Vitro Vehicle Effects on Borrelia burgdorferi as Indicated by ATP-Dependent Metabolic Activity and Cell Counts

　　

摘要专业翻译 莱姆病的病原体伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）在美国及其他地区造成了重大的健康和经济负担。开发抑螺旋体或杀螺旋体药物需要使用溶剂载体。载体耐受性可能影响抗菌筛选试验的解读。研究人员检测了二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）、氢氧化钠（sodium hydroxide, NaOH）和乙醇（ethanol, EtOH）对伯氏疏螺旋体生长的影响。螺旋体暴露于浓度为0.15%至2.4%（v/v）的载体中。培养物通过暗视野显微镜和商业细胞活力检测进行评估。在二甲基亚砜处理组中，细胞计数或ATP依赖性发光未见显著降低。氢氧化钠被证明不适合作为未缓冲的碱性载体。乙醇在中浓度下产生不一致的ATP依赖性发光与细胞计数终点结果，尽管在1.2%浓度下仍可检测到细胞存在。终点之间的差异可能源于暴露引起的细胞应激。这些结果表明，这些载体的种类和浓度对伯氏疏螺旋体的生长和ATP依赖性代谢活性产生差异化影响。高通量方法的适用性可能受到引起应激诱导变化的条件影响。未来研究应探索分子效应与观察到的细胞计数和代谢活性差异之间的关系。

论文解读

一、研究背景与意义

蜱虫持续对全球公共卫生和经济构成挑战。伯氏疏螺旋体是莱姆病的病原体，主要流行于北美、北欧和北亚地区。据估计，美国每年约有47.6万人被诊断并接受莱姆病治疗。由于生态和人为因素导致蜱虫地理分布范围扩大和丰度增加，莱姆病及其他蜱传疾病的负担持续上升。莱姆病通常表现为游走性红斑，口服多西环素可缓解症状，但部分病例可进展为累及其他器官系统的播散性疾病。尽管早期抗生素治疗总体有效，学界仍持续关注开发针对伯氏疏螺旋体的新型抗菌策略，这些策略可为人类或伴侣动物治疗提供补充工具，也可用于靶向储存宿主的干预措施，以降低宿主搜寻蜱中伯氏疏螺旋体的感染率。

伯氏疏螺旋体是一种专性宿主相关的螺旋体，在脊椎动物储存宿主和蜱之间维持地方性动物病循环。体外研究对于研究抗菌药物敏感性至关重要。螺旋体可在Barbour-Stoenner-Kelly（BSK）培养基及其变体中培养繁殖。该培养基基于CMRL-1066组织培养基并补充血清及其他营养物质。伯氏疏螺旋体对环境条件特别敏感，盐度、氧化还原状态等条件的微小变化即可触发影响代谢和复制的生理反应。

这种环境敏感性在候选抗菌药物及其他生物活性化合物的细胞反应研究中尤为重要。在这些实验中，活力或生长的变化应归因于活性成分而非实验系统引入的应激，以提高测定的生理相关性。活性成分通常需要借助载体递送到培养体系中以解决溶解性或稳定性限制。载体化合物通常被认为在足够低的最终浓度下具有生物学惰性，但其他微生物系统中的研究表明，即使低浓度溶剂暴露也可能影响膜生理和基因表达，进而影响代谢输出和酶活性。不同微生物物种对载体的耐受性不同。由于伯氏疏螺旋体对环境条件特别敏感，即使微小的载体相关效应也可能改变生长或活力读数，并可能因协同作用混淆抗菌活性的解读。

二、研究目的与主要技术方法

本研究旨在明确DMSO在伯氏疏螺旋体培养物中低至中浓度范围的总体效应，同时评估NaOH和EtOH作为具有不同理化性质、可能适用于不同溶解性需求化合物的载体。研究将直接暗视野显微镜细胞计数与BacTiter-Glo三磷酸腺苷（ATP）依赖性发光配对作为终点，通过直接计数和适用于高通量筛选的代谢活性估计来评估载体效应，主要目标是确定这些化学物质可用于体外药物筛选的浓度范围。

研究人员使用伯氏疏螺旋体B31株5A1克隆（BEI Resources NR-13251），在含6%兔血清的BSK-IIB培养基中繁殖。该克隆具有明确的质粒谱并保留高感染性表型。螺旋体以500,000细胞/mL接种于密封的1.5 mL管中（三个生物学重复），在34°C下孵育。DMSO、NaOH（1 N）和EtOH在零天加入培养物中，终浓度为0.15%、0.3%、0.6%、1.2%和2.4%（v/v）。NaOH对应的溶液摩尔浓度为1.5、3.0、6.0、12.0和24.0 mM。接种后第六天进行终点评估。发光按BacTiter-Glo细胞活力检测标准方案测量，该试剂化学裂解细菌细胞释放细胞内ATP，荧光素酶介导的发光反应的光输出作为代谢活性生物量的估计。每个生物学重复在四个技术重复孔中分析。同时进行了ATP-only验证实验以确保EtOH不影响检测读数。等分试样在甘油中冷冻保存以保持复制的横截面状态用于计数，每管计数三次。研究还定性评估了螺旋体形态是否存在多形性形式。数据分析使用GraphPad Prism 11软件，采用双因素方差分析（ANOVA）评估载体种类和浓度效应，并通过Tukey校正简单效应比较和Dunnett多重比较检验进行组间比较，同时进行Pearson和Spearman相关性分析及差异分析评估两个终点之间的一致性。

三、研究结果

DMSO对伯氏疏螺旋体的影响。 在测试的浓度范围内，DMSO未观察到显著效应。细胞计数和ATP依赖性发光均未出现显著降低。双因素ANOVA显示DMSO各浓度间无显著成对差异，与BSK-IIB-only对照组相比，DMSO各浓度在任一终点均无显著差异。DMSO暴露下未观察到多形性形态。

NaOH对伯氏疏螺旋体的影响。 NaOH表现出最高的敏感性，呈剂量依赖性生长抑制。细胞计数在0.15%浓度即开始显著降低，0.3%和0.6%浓度下降更为显著。发光在0.30%和0.60%浓度显著降低。在1.2%和2.4%浓度下未观察到细胞。较高浓度下，细胞计数减少伴随明显的多形性形态（主要为动态圆形形态），提示NaOH暴露相关的细胞应激。BSK-IIB添加NaOH后的pH范围为8.01（1.5 mM）至9.64（24.0 mM），对照组pH为7.7。

EtOH对伯氏疏螺旋体的影响。 EtOH产生浓度依赖性效应。细胞计数在0.15%、0.30%和0.60%之间无显著差异，1.2%浓度下显著降低，2.4%浓度下未检测到细胞。值得注意的是，ATP依赖性发光在0.60%和1.20%浓度下显著高于0.15%和0.30%浓度，与细胞计数趋势出现分歧。在0.60%和1.20%浓度下，发光相对于对照组增加而细胞计数在0.60%保持接近对照、在1.20%下降。0.3%以上浓度观察到更频繁和更大的螺旋体聚集体。

终点一致性分析。 包含零值的相对ATP读数与细胞计数之间存在强且显著的秩相关（Rs = 0.646，p < 0.001），但线性关系较弱且不显著（r = 0.261，p = 0.084）。差异分析显示，DMSO和NaOH组的发光与细胞计数趋势一致，未发现显著差异。EtOH暴露在0.60%（D = 2.759，p = 0.005）和1.20%（D = 5.779，p = 0.0188）浓度下产生显著终点不一致性。

四、讨论与结论

研究讨论指出，DMSO未导致细胞计数或测定活力的降低，扩展了先前研究中DMSO在低浓度下不损害复制的发现，并支持DMSO在BacTiter-Glo终点下高达2.4%浓度不影响结果。然而，其他系统中的证据表明，亚致死浓度的DMSO仍可诱导显著的生理变化，包括膜性质和生物大分子组成改变。因此，基于宏观观察的无毒剂量可能并非真正惰性。DMSO是操作上最兼容的测试载体。

EtOH在本研究中降低了细胞密度，机制上可广泛应激细胞包膜和蛋白质，并影响次级代谢包括氧化应激反应和活性氧相关通路。细胞计数与ATP依赖性发光在高达1.2%浓度下的分歧可能反映了代谢应激状态的变化。先前研究显示EtOH可作为化学排斥剂改变伯氏疏螺旋体的鞭毛行为而不引起可检测的细胞裂解。ATP依赖性发光应被解释为代谢活性生物量的估计而非细胞数的直接测量。研究支持EtOH在低于0.6% v/v浓度下使用。

NaOH作为未缓冲碱性载体被证明不合适。伯氏疏螺旋体对pH变化敏感，pH通常维持在7.4至7.8以支持生长。碱性条件可破坏质子梯度和膜电位，可能导致细胞裂解和死亡，也可能改变蛋白质结构。这些效应可能是观察到的应激相关形态变化的原因。研究建议避免在BSK-IIB中使用未缓冲的NaOH。

研究局限性包括使用单一菌株和单一改良BSK配方，外部有效性有限；仅测试了三种载体；生物学样本量较小限制了检测更微妙效应的敏感性。非显著比较不应被解释为完全生物学惰性的证据。

研究结论：在测试条件下，DMSO在高达2.4% v/v浓度下未观察到细胞计数或ATP依赖性发光的统计学显著降低，但建议优先使用满足溶解性所需的最低浓度。EtOH可在低于0.6% v/v浓度下使用。应避免使用未缓冲的NaOH，因为极低浓度下即出现细胞计数和发光抑制。这些建议受限于这两个测量终点和B31 5A1克隆。这些表观兼容浓度下可能存在的分子或生理效应以及第六天终点之外的效果需要进一步验证。总体而言，本研究扩展了对可用于伯氏疏螺旋体体外研究的载体种类和浓度范围的理解。