CO?介导的氨基甲酰化翻译后修饰：连接二氧化碳生物学与蛋白质调控的桥梁

《TRENDS IN Biochemical Sciences》：Carbamate post-translational modifications: bridging CO2 biology and protein regulation

　　

摘要专业翻译 二氧化碳（CO2）是一种具有生物活性的气体，对包括代谢、酸碱稳态和化学感知在内的多项重要生理过程不可或缺。CO2可通过刺激或抑制特定细胞信号传导通路（包括核因子-κB（NF-κB）、钙离子和Wingless（Wnt）通路）直接调节这些过程。CO2与蛋白质相互作用以调节细胞信号传导的机制之一，是通过对α-N-末端和赖氨酸ε-氨基基团进行可逆的非酶促修饰，形成氨基甲酰化翻译后修饰（carbamate post-translational modification，PTM）。由于这些修饰极易逆转，鉴定氨基甲酰化PTM在技术上具有挑战性。然而，新兴技术现已使其鉴定和功能表征成为可能。本综述总结了实验和计算方法在鉴定CO2介导的PTM方面的最新进展。

论文解读

一、研究背景与意义

二氧化碳（CO₂）是生命活动的基础性气体分子，既是光合作用和化能合成的基本底物，也是有氧呼吸的终产物。在人体中，CO₂分压（PaCO₂）被严格维持在35–45 mmHg的狭窄范围内，高碳酸血症和低碳酸血症均可导致病理后果，表明CO₂是一种受精密调控的重要生物信号。尽管CO₂在生理和行为层面的响应已被广泛记录，但介导这些响应的CO₂响应性信号通路以及直接响应CO₂的蛋白质仍知之甚少。

CO₂直接调节蛋白质功能的一种机制是通过在中性α-N-末端或赖氨酸ε-氨基基团上形成可逆的氨基甲酰化翻译后修饰（PTM），该修饰称为carbamylation。早期对血红蛋白（Hb）和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）的研究确立了carbamylation作为一种生理上重要的PTM的地位。然而，由于carbamate修饰极易逆转，其鉴定在技术上长期面临巨大挑战，这严重限制了人们对CO₂介导蛋白质调控机制的全面理解。因此，开发可靠的实验和计算方法来鉴定carbamate PTM，对于揭示CO₂生物学功能、探索相关疾病治疗靶点以及提高作物固碳效率均具有重要意义。该论文发表在《TRENDS IN Biochemical Sciences》上。

二、主要关键技术方法

研究人员在综述中系统梳理了carbamate PTM鉴定的主要技术路线。其一为三乙基氧鎓离子（TEO）化学捕获法，利用水溶性Meerwein试剂在生理pH下将乙基不可逆转移至carbamate氧原子上，形成稳定的氨基甲酸乙酯（R-NH-CO-OEt），随后可通过串联质谱（MS/MS）鉴定，对应赖氨酸处72.0211 m/z的质量偏移，并可通过¹³CO₂重复实验（+1 m/z偏移）加以确认。其二为赖氨酸羧化竞争质谱法（LysCarComp-MS），该方法利用CO₂模拟物异氰酸（OCNH）将未保护的赖氨酸转化为高瓜氨酸（hCit），通过CO₂/OCNH竞争实验间接检测carbamate位点，已在Escherichia coli和Synechocystis sp. PCC 6803蛋白质组中鉴定出20个此前未知的carbamate PTM。此外，X射线晶体学和¹³C核磁共振（¹³C-NMR）作为正交验证手段也被广泛采用。计算方法方面，研究人员综述了四种carbamate位点预测模型，包括基于单类K近邻（KNN）的方法、赖氨酸羧化预测器（PreLysCar）、基于统计矩和伪氨基酸组成（PseAAC）的神经网络模型以及基于信息熵的动态查询驱动样本重缩放（pDQD-SR）算法。

三、研究结果

CO₂的生物学特性。 论文首先概述了CO₂在细胞、组织和有机体生理中的广泛作用，包括代谢、酸碱稳态和运输等。在细菌中CO₂对生长存活至关重要；采采蝇和蚊子通过检测CO₂产生食物吸引行为；小鼠对低至0.2%的CO₂表现出先天回避。已鉴定的CO₂响应性信号通路包括哺乳动物中的AMP活化蛋白激酶（AMPK）和Na⁺/K⁺-ATPase、NF-κB通路、calpain/caspase-7/RhoA通路、Ca²⁺信号、昆虫中的Gr21a/Gr63a、啮齿动物中的鸟苷酸环化酶-D（GC-D）阳性神经元以及Arabidopsis中的SLAC1/蛋白激酶/脱落酸依赖性通路。直接响应无机碳的信号蛋白仅包括动物、真菌和原核生物的Class III核苷酸环化酶、部分连接蛋白（如Cx26）、哺乳动物受体蛋白酪氨酸磷酸酶γ、泛素、Synechocystis sp. PCC 6803的PII蛋白以及植物和真菌的蛋白磷酸酶2C（PP2C）。

蛋白质–CO₂相互作用的早期研究。 血红蛋白（Hb）方面，20世纪30年代的血液研究证实CO₂可快速可逆地结合Hb形成氨基甲酰血红蛋白，主要反应位点为脱氧Hb的N末端α-氨基，尤其是Val-1β。该修饰与O₂状态偶联，构成Haldane效应：Hb氧合降低其对CO₂的亲和力，促进CO₂在肺中释放；脱氧则增加CO₂结合能力并稳定T态构象，与Bohr效应协同优化O₂卸载和CO₂摄取。Rubisco方面，其激活依赖于非底物CO₂分子对大亚基特定赖氨酸（Lys-201）的carbamylation，随后结合Mg²⁺形成CO₂·Mg²⁺·酶复合物。该carbamate形成与羧化反应中使用的CO₂不同，于20世纪60–70年代被阐明，且Rubisco活化对CO₂浓度呈线性依赖。

鉴定carbamate PTM的工具。 论文详细介绍了TEO捕获法和LysCarComp-MS法两种核心鉴定技术。TEO捕获法已成功鉴定多种蛋白质中的carbamate位点，包括Hb的Val-1β和K99、哺乳动物泛素的K6、K33、K48和K63、连接蛋白26（Cx26）胞质环中的五个赖氨酸残基（K108、K112、K116、K122和K125）以及藻蓝蛋白（allophycocyanin）α亚基的K6等。LysCarComp-MS法在E. coli和Synechocystis sp. PCC 6803蛋白质组中鉴定出20个新位点。值得注意的是，两种方法鉴定的位点重叠有限，例如TEO捕获法无法鉴定Rubisco活性位点赖氨酸和泛素的N端、K6、K63位点，提示不同方法可能偏向检测具有不同局部环境特征的carbamate位点，因此需要正交验证。此外，TEO捕获法在Arabidopsis核苷二磷酸激酶（AtNDK1）K9位点鉴定到carbamate PTM，但功能分析未发现该修饰的生物学后果，提示并非所有carbamate PTM均具有功能。

鉴定carbamate PTM的局限性。 质谱（MS）技术虽推进了PTM鉴定，但低蛋白丰度、离子抑制、低动态范围、序列覆盖不完整以及碰撞诱导解离导致的PTM丢失等问题限制了其应用。针对carbamate修饰的特异性抗体因表位过小而难以开发，因此需要正交方法进行验证。

carbamate PTM发现的计算方法。 论文综述了四种carbamate位点预测模型。Huang等人（2013）提出的单类KNN方法结合一级序列和二级结构，在独立测试集上达到66.67%灵敏度和100%特异性，但训练集仅含40个肽段。Jimenez-Morales等人（2014）开发的PreLysCar通过编码赖氨酸微环境特征（带电或极性氨基酸、水分子和金属离子的距离）训练贝叶斯分类器，在90%序列相似性削减下达到83.72%灵敏度和99.58%特异性，但66%的正样本为金属稳定化位点。Amanat等人利用统计矩和PseAAC特征训练神经网络，在723个正位点和1197个负位点数据集上实现94.26%准确率。Ning等人开发的pQLyCar采用pDQD-SR算法解决数据不平衡问题，结合信息增益特征选择和SVM分类器，在五折交叉验证中达到97.66%准确率、99.59%灵敏度和96.49%特异性。尽管这些模型在已知位点上表现良好，但对非埋藏、非金属稳定化位点的预测能力仍有限。

四、总结与结论

论文总结指出，TEO捕获和LysCarComp-MS等新技术的发展克服了carbamate PTM因快速可逆性而难以鉴定的障碍，已在多种蛋白质中发现新的CO₂介导的carbamate PTM并证实其功能效应，包括藻蓝蛋白AB（ApcAB）、PII蛋白、泛素和连接蛋白26。计算预测模型与实验探索相结合，为PTM鉴定提供了靶向性策略。然而，并非所有carbamate PTM都具有功能效应，这引发了一个重要问题：能否开发出新方法区分功能性与非功能性carbamate PTM？采用多学科方法，将生化技术与计算预测建模和模拟相结合，有望发现更多carbamate PTM。鉴定更多CO₂ PTM位点可能为免疫反应（如NF-κB通路介导的反应）提供新的靶向治疗策略，或通过工程化改造Rubisco组分提高作物产量。