敲除预测的β-(1,3)-葡聚糖合酶基因bgs1改变裂褶菌细胞壁组成并影响生长与子实体形成

《The Cell Surface》：Deletion of the predicted β-(1,3)-glucan synthase gene bgs1 changes the cell wall composition and impacts growth and fruiting body formation of Schizophyllum commune

　　

β-(1,3)-葡聚糖对真菌细胞壁的完整性以及真菌与（非）生物环境的相互作用至关重要。例如，β-(1,3)(1,6)-葡聚糖裂褶菌素（schizophyllan）可保护真菌免受热胁迫、饥饿和竞争。像裂褶菌（Schizophyllum commune）这样的伞菌纲（Agaricomycetes）真菌拥有两个β-(1,3)-葡聚糖合酶（β-(1,3)-glucan synthase, bgs）基因。本研究将针对bgs1和bgs2基因的敲除构建体导入S. commune中。未能获得Δbgs2菌株。bgs1失活导致水溶性多糖产量降低约2倍，该多糖的傅里叶变换红外光谱（FTIR）特征与裂褶菌素一致。此外，固态核磁共振（solid state NMR）显示，在敲除菌株细胞壁刚性部分中，β-(1,3)-葡聚糖/β-(1,3)(1,6)-葡聚糖（裂褶菌素）的相对水平下降了5倍，同时几丁质（chitin）和α-(1,3)-葡聚糖的相对水平分别增加了3.3倍和2.7倍。这些细胞壁组成的变化伴随着生长减缓、子实体形成受损以及孢子产生缺失。总之，这些数据首次揭示了在一种蘑菇形成真菌中敲除β-(1,3)-葡聚糖合酶基因对细胞壁组成、生长和子实体发育的影响。

研究背景与目的

β-(1,3)-葡聚糖是真菌细胞壁的重要组成部分，对于维持细胞壁完整性和真菌与环境之间的相互作用至关重要。裂褶菌（Schizophyllum commune）是一种广泛分布的担子菌，常被用作研究蘑菇发育、菌丝材料、细胞壁结构和真菌免疫系统的模式生物。其细胞壁由内层刚性核心和外层可动部分组成，其中β-(1,3)(1,6)-葡聚糖裂褶菌素（schizophyllan）在抵御温度胁迫、饥饿和竞争中发挥关键作用，并可作为胞外储存碳源。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，β-(1,3)-葡聚糖合酶由催化亚基Fks和调节亚基Rho1组成，基因组中含有FKS1、FKS2和FKS3三个基因。在许多其他真菌中也鉴定出了β-(1,3)-葡聚糖合酶（bgs）基因。值得注意的是，许多蘑菇形成真菌含有两个bgs基因，编码I型和II型β-(1,3)-葡聚糖合酶，但其功能差异尚不清楚。此前，关于蘑菇形成真菌中β-(1,3)-葡聚糖合酶基因功能的研究仅限于灰树花（Grifola frondosa），其中通过RNAi沉默一个葡聚糖合酶基因导致了菌落扩展和生物量减少。本研究旨在探究S. commune中I型和II型β-(1,3)-葡聚糖合酶基因bgs1和bgs2的功能角色。

主要关键技术方法

研究人员利用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，结合预组装的Cas9-sgRNA核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP）复合物和修复质粒，通过聚乙二醇（PEG）介导的转化方法将敲除构建体导入S. commune原生质体中，尝试敲除bgs1和bgs2基因。成功获得的Δbgs1菌株通过与野生型菌株杂交恢复了ku80基因，并通过随机整合方式引入完整的bgs1基因进行回补实验。研究人员采用实时定量PCR（qPCR）检测基因表达，使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析水溶性多糖，并运用快速魔角旋转固态核磁共振（fast MAS solid state NMR）技术分析¹³C-葡萄糖和¹⁵NH₄标记培养的菌株细胞壁成分。

研究结果

3.1 S. commune的bgs1和bgs2基因

双向BLAST比对发现S. commune中存在bgs1（Schco3|2628724）和bgs2（Schco3|2035630）两个预测的β-(1,3)-葡聚糖合酶基因。它们与酵母FKS1-3基因的氨基酸序列一致性为48.8%-55.0%，两者之间的一致性为71.3%，相似性为83.4%。这两个基因分别编码I型和II型伞菌纲β-葡聚糖合酶，其蛋白质产物包含一个糖基转移酶（glycosyltransferase, GT）结构域、17个预测的跨膜螺旋（transmembrane helix, TM）以及位于多肽N端的固有无序区域（intrinsically disordered region, IDR）。I型和II型合酶的IDR存在明显区别，分别含有DPF和NPF基序，这些基序参与网格蛋白介导的内吞作用。转录组数据显示，bgs1和bgs2在子实体发育过程中具有相似的表达模式，均在II期原基中表达显著升高。

3.2 bgs1的敲除

研究人员成功获得了Δbgs1菌株，但经过五次尝试均未获得bgs2敲除转化子，仅得到15个通过单交换整合了修复质粒的转化子。通过杂交回补ku80后获得了兼容的H4-8AΔbgs1和H4-8BΔbgs1敲除菌株，并通过qPCR确认。随后对H4-8BΔbgs1菌株进行了回补，qPCR证实bgs1表达恢复。有趣的是，qPCR还表明bgs1失活并未导致bgs2表达上调。

3.3 生物量和水溶性多糖的产生

与野生型和回补菌株相比，Δbgs1菌落更小、更致密。Δbgs1菌株的生物量（0.03 g）低于野生型（0.06 g）和回补菌株（0.06 g）。从洗涤液中乙醇沉淀的多糖经FTIR分析显示与纯化裂褶菌素谱图相似。Δbgs1菌株产生的乙醇沉淀物（27.9 mg g^-1菌丝）少于野生型（54.71 mg g^-1菌丝）和回补菌株（44.34 mg g^-1菌丝）。所有菌株培养基的pH值均低于5.2，处于有利于分泌裂褶菌素的范围内。结果表明，bgs1敲除影响了生物量和具有裂褶菌素FTIR特征的水溶性多糖的产生。

3.4 子实体和担孢子的形成

由于S. commune不能在MM-N琼脂上结实，因此使用了SCMM琼脂。Δbgs1Δbgs1双核体形成的子实体比野生型小，其子实层表面光滑而非野生型的肋状表面。显微镜检查显示所有菌株的子实层中均有担子形成，但Δbgs1Δbgs1的担子不产生孢子。野生型杂交、野生型Δbgs1杂交和Δbgs1 Δbgs1::bgs1杂交分别形成了129.8 × 10⁶ ± 16.3 × 10⁶、55 × 10⁶ ± 14.4 × 10⁶和14.5 × 10⁶ ± 3.2 × 10⁶个孢子。此外，Δbgs1Δbgs1子实体质地较软，释放黄橙色渗出液，菌落还产生了蓝色色素和深色变色。当Δbgs1菌株与兼容的野生型或回补菌株杂交时，生长和子实体形成恢复正常。这表明双核体中单个bgs1拷贝足以支持完全发育，但不能产生与野生型bgs1bgs1双核体相同数量的担孢子。

3.5 细胞壁组成

通过固态核磁共振比较了水提取后的Δbgs1和野生型菌株细胞壁组成。在Δbgs1菌株细胞壁的可动部分中，β-(1,3)-葡聚糖/β-(1,3)-(1,6)-葡聚糖的相对含量（47%）低于野生型（58%），α-(1,3)-葡聚糖的相对含量也较低（16% vs 28%），而脂质（15%）和氨基酸（17%）则较高。在细胞壁的刚性部分，差异更为显著：Δbgs1菌株中β-(1,3)-葡聚糖/β-(1,3)(1,6)-葡聚糖的相对水平仅为14%，而野生型为70%；相反，敲除菌株中α-(1,3)-葡聚糖（51%）和几丁质（30%）的相对水平远高于野生型（分别为19%和9%）。回补菌株的细胞壁组成与野生型相似。综上，bgs1失活降低了细胞壁刚性核心中β-(1,3)-葡聚糖/β-(1,3)(1,6)-葡聚糖的相对含量，同时伴随α-(1,3)-葡聚糖和几丁质相对水平的升高。

讨论与结论

此前，蘑菇形成真菌中β-(1,3)-葡聚糖合酶基因的作用仅在灰树花（Grifola frondosa）中进行过研究，其中GFGLS基因的RNAi沉默导致菌落延伸和生物量减少。本研究表明，S. commune的bgs1基因同样参与营养生长和胞外多糖的释放。此外，研究首次揭示了bgs1在细胞壁组成、子实体形成和担孢子发育中的作用。I型和II型β-(1,3)-葡聚糖合酶在进化上的分化也体现在其N端固有无序区域的差异上，分别含有DPF和NPF基序，这些基序可能通过网格蛋白介导的内吞作用影响蛋白质的定位或功能，未来研究应评估这些基序的功能后果。bgs1失活导致细胞壁刚性核心中β-(1,3)-葡聚糖/β-(1,3)(1,6)-葡聚糖相对丰度降低5倍，这可能部分由几丁质和α-(1,3)-葡聚糖的相对增加所补偿。然而，这种补偿不足以维持正常的生长速率和形态发生，表现为生长减缓、子实体形成受损和孢子产生缺失。无法获得bgs2敲除菌株暗示该基因可能对S. commune的生存力至关重要，或者其功能与bgs1不同。综上所述，这些数据首次证明了在一种蘑菇形成真菌中敲除β-(1,3)-葡聚糖合酶基因对细胞壁组成、生长和子实体发育的影响。