胞质顺式作用环路限制PI3K/AKT驱动的膀胱癌细胞谱系可塑性

《Cellular Signalling》：A cytoplasmic cis-acting circuit confines PI3K/AKT-driven lineage plasticity in bladder cancer

　　

摘要
膀胱癌（BCa）是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，其特征是复发率高，且晚期疾病的治疗选择有限。环状 RNA（circRNAs）已成为癌症基因表达的关键调节因子，但其在 BCa 进展中的作用仍未完全被理解。在此，鉴定出 circ_0006845（circNFAT5）是一种抑癌环状 RNA，在 BCa 组织和细胞系中显著下调。功能测定表明，circNFAT5 在体外抑制 BCa 细胞的增殖、迁移和侵袭，并在体内抑制皮下肿瘤生长。机制上，circNFAT5 主要定位于细胞质，并通过竞争性吸附 miR-552-3p 作为竞争性内源 RNA（ceRNA）发挥作用，从而解除对 Forkhead 盒 O1（FoxO1）转录因子的转录后抑制。单细胞 RNA 测序分析进一步鉴定出泛素 C（UBC）为 FoxO1 的潜在下游靶点，ChIP-seq 数据支持 FoxO1 在 UBC 启动子上的占据，计算对接预测了潜在的相互作用。细胞间通讯分析鉴定出 ANNEXIN、COMPLEMENT、SEMA3、VEGF 和 VISFATIN 为主要的 PI3K/AKT 相关轴，介导肿瘤微环境中 FoxO1 低表达肿瘤亚群与基质细胞之间的交叉对话。药物敏感性分析预测，FoxO1 低表达的 BCa 细胞可能对顺铂、吉西他滨以及 PI3K/AKT/mTOR 通路抑制剂表现出增强的敏感性。这些发现描绘了一条与 PI3K/AKT 信号传导相关的 circNFAT5/miR-552-3p/FoxO1/UBC 调控轴，该轴可能有助于 BCa 的进展，并将 FoxO1 指定为候选预后生物标志物及潜在的治疗分层标志物。

引言
膀胱癌（BCa）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，2022 年全球报告约有 614,000 例新发病例和 220,000 例死亡 [1]、[2]。该疾病表现出明显的复发倾向和进展为肌层浸润表型的特性，这与极差的长期生存率相关 [3]、[4]。尽管在根治性膀胱切除术、铂类化疗和免疫检查点阻断等治疗方面取得了进步，转移性 BCa 患者的五年生存率仍低于 15% [5]。改善临床结果的一个根本障碍是对驱动 BCa 启动、进展和治疗耐药的分子电路理解不完整 [6]。因此，阐明维持恶性表型的关键调控网络对于鉴定预后生物标志物可操作的治疗靶点至关重要。

环状 RNA（circRNAs）代表了一大类进化保守的内源性表达单链转录本，其通过反向剪接产生共价闭合环状结构 [7]、[8]。曾经被认为是异常剪接的副产物，circRNAs 现已被认为是基因表达的多层次调节因子，包括转录调控、转录后加工和翻译控制 [9]。由于缺乏自由末端，circRNAs 对外切核酸酶降解具有卓越的抗性，赋予其半衰期 substantially 超过其线性 counterparts，并使其能够以组织和发育阶段特异性方式稳定积累 [10]、[11]。circRNA 功能的一个既定机制是作为竞争性内源 RNA（ceRNAs），通过序列互补隔离微小 RNA（miRNAs），从而解除 miRNA 对下游 mRNA 靶标的抑制 [12]。这种 ceRNA 交叉对话构成了转录后调控的复杂层次，其失调已被确定与多种病理过程有关，包括恶性转化、上皮 - 间充质转化（EMT）和转移定植 [13]、[14]。在 BCa 背景下，越来越多的 circRNAs 被报道通过吸附抑癌 miRNAs 来调节肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭 [15]、[16]。然而，BCa 中功能相关 circRNAs 的全貌仍 largely uncharted，这些 circRNAs 发挥其致癌或抑癌功能所通过下游效应通路尚未被系统探索。

在 BCa 中，多种信号通路促肿瘤进展，包括 JAK/STAT3 级联，其已被证明能促进增殖、EMT 和肿瘤生长 [17]。PI3K/AKT 通路是最常失调的致癌级联之一，约 25% 的病例中鉴定出 PIK3CA 的激活突变，另有一大部分病例存在抑癌基因 PTEN 的功能丧失改变，以及通过扩增或突变的受体酪氨酸激酶如 FGFR3 和 ERBB2 的上游激活 [18]、[19]。PI3K/AKT 信号的过度激活与 BCa 患者的高肿瘤等级、晚期病理分期、淋巴结转移和降低的总生存率 strongly correlated [20]。PI3K/AKT 级联的一个关键下游介质是 Forkhead 盒 O（FoxO）转录因子家族，其中 FoxO1 充当关键抑癌因子 [21]、[22]。在生理条件下，FoxO1 位于细胞核内并反式激活涉及细胞周期阻滞、凋亡、氧化应激抵抗和 DNA 损伤修复的基因 [23]。当 PI3K/AKT 激活时，AKT 在三个保守残基（Thr24、Ser256 和 Ser319）上直接磷酸化 FoxO1，触发其结合 14–3-3 伴侣蛋白，核排出及随后的泛素依赖性蛋白酶体降解 [24]。这种磷酸化依赖性 FoxO1 失活有效地 silences 其抑癌转录程序，是侵袭性恶性肿瘤的特征 [25]。尽管 BCa 中 FoxO1 失活已被记录在案，但在转录后水平精细调节 FoxO1 表达的上游非编码 RNA 调节因子仍 poorly defined。

单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）和计算系统生物学的最新进展使得能够 unbiased、高分辨率地剖析肿瘤组织内的转录组异质性，促进发现新的细胞类型特异性基因调控网络和细胞 - 细胞通讯轴 [26]。当与转录因子结合位点映射的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）及蛋白质 - 蛋白质相互作用预测的分子对接模拟相结合时，这些多组学方法提供了一个强大的框架，用于全面解码癌症信号通路的分子架构 [27]、[28]。采用了一种整合多组学策略，结合临床 BCa 样本、体外和体内功能测定、scRNA-seq、ChIP-seq 和计算对接，以鉴定涉及 circNFAT5、miR-552-3p、FoxO1 及其下游靶点 UBC 的候选调控级联，该级联汇聚于 PI3K/AKT 通路以促进 BCa 进展。

部分片段
数据来源和人类样本
本研究分析的可公开获取数据集详见表 S1。膀胱癌组织及配对的邻近正常组织（n = 38 对）收集自广东医科大学附属医院接受手术切除的患者。已获所有参与者书面知情同意。本研究符合《赫尔辛基宣言》并经医院机构伦理委员会批准（PJKT2023–134）。新鲜组织被

BCa 中 circ_0006845 (circNFAT5) 的鉴定与表征
为了鉴定可能参与 BCa 进展的 circRNAs，我们分析了 GSE97239 数据集（n = 3）中的 circRNA 表达谱。筛选出五个下调候选者（图 1A）。其中，circNFAT5 在膀胱癌细胞系（T24、UM-UC-3、5637）中相对于永生化正常尿路上皮细胞系 SV-HUC-1 表现出最显著的下调（P < 0.01）（图 1B）。同样，对 38 对 BCa 和邻近正常组织的 qRT-PCR 分析证实了 circNFAT5 表达

讨论
尽管手术和系统治疗取得了进步，晚期 BCa 患者的预后仍然很差，这主要归因于高复发倾向、进展为肌层浸润性疾病以及化学耐药性的发展 [43]。这些侵袭性表型背后的分子异质性尚未完全被理解，限制了对 robust 预后生物标志物和有效治疗靶点的鉴定 [44]、[45]。本研究鉴定出 circNFAT5 作为一种

结论
本研究鉴定出 circNFAT5 是一种在 BCa 中下调的抑癌环状 RNA。circNFAT5 在体外抑制 BCa 细胞的增殖、迁移和侵袭，并在体内抑制皮下肿瘤生长。机制上，circNFAT5 通过吸附 miR-552-3p 作为 ceRNA，解除对 FoxO1 的转录后抑制。单细胞转录组分析揭示了 FoxO1 相关的 UBC 调控联系，ChIP-seq 数据支持 FoxO1 在 UBC 启动子上的占据，计算

局限性
应承认本研究的若干局限性。38 对样本主要验证了 circNFAT5 的下调；不完整的临床病理标注阻碍了分期、分级和淋巴结分析，需要更大前瞻性标注队列进行临床和预后评估。体内实验仅限于每组样本量较小的皮下异种移植模型（n = 4），不能完全重现原位

CRediT 作者贡献声明
Xuan Dong: 写作 - 原始草稿，验证，软件，形式分析。Yutong Li: 写作 - 原始草稿，可视化，项目管理，方法论，形式分析，概念化。Yongtai Yan: 写作 - 原始草稿，验证，调查，数据整理。Hong Xiong: 写作 - 审阅与编辑，验证，调查，数据整理。Pulin Wu: 写作 - 原始草稿，调查，数据整理。Yongjie Chen: 写作 - 审阅与编辑，验证，调查，

伦理批准和参与同意
所有动物实验均按照中华人民共和国科学技术部发布的《实验动物管理条例》进行。体内实验经广东医科大学附属医院实验动物伦理委员会批准（AHGDMU-LAC-B202306–0043）。

伦理声明
所有参与者或其法定代表人已获书面知情同意参与本研究并发布本文。已遵守参与者的隐私权。
本研究包括器官或组织捐赠者。本研究包括人类生物材料，捐赠者、或其近亲或法定代表人同意在本研究中使用及发布本文。本研究使用的样本未 sourced from executed

资金
本研究由广东省基础与应用基础研究基金（2024A1515012742）、广东省医学科学研究基金会（A2024489）、中华医学会医学教育分会研究项目（2023B072）、广东医科大学本科创新创业教育基地项目（JDXM2024050F, JDXM2025050F, JDXM2025051F）及广东医科大学本科创新和

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争经济利益或个人关系，这些可能影响本文报道的工作。

致谢
不适用。

Xuan Dong|Yutong Li|Yongtai Yan|Hong Xiong|Pulin Wu|Yongjie Chen|Zhaofeng Yi|Cong Zhou|Ling Zuo|Hongwei Liu
广东医科大学附属医院泌尿外科实验室，中国广东省湛江市 524001