循环瓜氨酸化蛋白：癌症液体活检的候选分析物

《Clinica Chimica Acta》：Circulating citrullinated proteins as candidate liquid biopsy analytes in cancer

　　

# 肿瘤液体活检中瓜氨酸化蛋白作为研究分析物的现状

## 核心要点

- 瓜氨酸化蛋白在肿瘤液体活检中仍属于仅供研究使用的分析物。
- 核小体瓜氨酸化组蛋白检测与游离肽瓜氨酸化组蛋白检测不可相互替代。
- 参考物质与外部质量评估（EQA）的缺失目前限制了检测方法的标准化。
- 多标志物瓜氨酸化检测面板需要前瞻性临床验证。

## 引言

尽管癌症仍是全球主要的死因之一，但由于液体活检技术的分析成熟化，临床化学在肿瘤检测、分层和监测中的角色日益重要。循环游离脱氧核糖核酸（cfDNA）、甲基化标记和蛋白分析物正在多癌种早期检测项目中进行评估，例如PATHFINDER项目——一项基于血浆的甲基化血液检测在超过6600名无症状成人中进行了前瞻性测试，证明了血浆来源癌症筛查在临床实践中的可行性[1]。cfDNA片段末端结构的高分辨率分析已得到互补性技术工作的进一步精细完善，能够从外周血中提取微量残留疾病（MRD）和肿瘤分数（TF）信号[2]。

在这一不断扩展的分析物景观中，蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是一类未被充分探索的候选生物标志物，而瓜氨酸化正是此类修饰的代表。肽基精氨酸被肽基精氨酸脱亚胺酶（PAD）家族转化为肽基瓜氨酸，导致每个修饰残基质量增加+0.984 Da，并丢失一个正电荷，从而相对于未修饰肽显著改变蛋白质的免疫原性、结构特性和信号功能[3]。

肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）是人类五种亚型之一，在机制研究中被提示参与致癌信号通路。它在结直肠癌（CRC）中调控糖原合酶激酶3β（GSK3β）的核定位以及细胞周期依赖性激酶抑制因子1A（CDKN1A）的抑制[4]。肽基精氨酸脱亚胺酶2（PAD2）和PAD4在结直肠肿瘤组织中高度表达，这与较差的临床病理特征和生存率相关[5]。此外，还有一些机制证据表明瓜氨酸化可能损害抑癌功能。近期一项生化研究显示，p53残基的脱亚胺化会阻断p53的泛素化和反式激活，但该机制在癌症中的意义尚未确定[6]。

循环中瓜氨酸化的另一条通路是通过中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成。PAD4介导的组蛋白H3过度瓜氨酸化是NETosis过程中染色质去凝聚所必需的，而实验和临床研究均表明，瘤内和外周NETs与转移扩散、化学抵抗和免疫抑制相关。在实验性神经内分泌癌模型中，已发现5-羟色胺诱导的组蛋白瓜氨酸化是启动肝转移的一个步骤[7]。排卵诱导的NETosis与使用排卵性腹腔液、肿瘤细胞和体内实验的卵巢高级别浆液性癌种植相关[8]。在胰腺腺癌中，胰腺切除术也会诱导NET释放，这是一种促癌因素[9]。这些数据应被视为与NETs相关分析物的机制证据，但不应解读为普遍促转移作用的证明，因为NET活性可能因肿瘤类型、疾病阶段和实验条件而异。

NET形成可通过瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）进行定量分析，该标志物与其他标记物一同已在高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）患者的外周血和腹水中进行了检测，并已在个体临床队列中显示出区分不同组别的能力[10]。除了NETosis之外，瓜氨酸化肽还被检测为自体T细胞识别的肿瘤新抗原，这对未来生物标志物驱动的免疫肿瘤学应用具有潜在意义，但并非伴随诊断[11]。

这些进展汇聚于可测量的血液分析物中，例如CitH3、瓜氨酸化及基质金属蛋白酶降解的波形蛋白（VICM）、循环PAD酶和瓜氨酸化细胞外囊泡（EV）货物。研究者利用酶免疫测定法、靶向质谱法以及新型生物传感器来研究这些分析物。尽管已有定量血清CitH3检测在研究和临床研究流程中被描述，但这并不意味着CitH3已成为常规可报告的肿瘤学分析物[12]。单分子超分辨率检测[13]也可用于探究EV中的瓜氨酸化特异性信号。

尽管取得了上述进展，但目前尚无经认证的参考物质（CRM）、标准化的分析前规范或针对肿瘤学瓜氨酸化标志物的外部质量评估（EQA）方案，且没有任何检测方法按照国际标准化组织（ISO）15189要求和体外诊断医疗器械法规（IVDR）的要求得到常规实施。第5节将详细讨论标准化、跨平台可比性和质量保证方面的要求。

因此，本文批判性地评估了循环瓜氨酸化蛋白作为液体活检分析物在肿瘤临床化学背景下的潜力。第一组测量将在血清、血浆、全血、EV、腹液及其他明确界定的液体活检组分中进行。组织、骨髓、体外和临床前研究仅在提供相关生物学或转化背景且与直接循环分析物研究明确区分时才纳入。本综述着重介绍了PAD生物化学和恶性疾病中瓜氨酸化的细胞来源，总结了主要的循环瓜氨酸化蛋白形式，回顾了相关检测方法、质谱法和生物传感器方法学，考虑了分析前和标准化问题，并讨论了在预后和治疗反应监测方面的初步应用，同时批判性地评估了其在诊断、MRD监测和伴随诊断中使用证据有限的现状。本综述还区分了跨队列和平台可重复的观察结果与因检测方法、环境或机制未明而存在差异的结果。

## 中性粒细胞胞外陷阱、瓜氨酸化与转移扩散

尽管PAD4依赖性NETosis在特定实验模型中与转移扩散相关，但不应将其视为所有癌症类型转移扩散的普遍驱动因素。近期一项实验研究显示，结直肠癌射频消融不完全后残余肿瘤细胞的存在导致CD177高表达（CD177hi）和肽基精氨酸脱亚胺酶4高表达（PAD4hi）中性粒细胞的募集，这些……

## 瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）

尽管CitH3是肿瘤学中量化最广泛的循环瓜氨酸化蛋白形式，但该标志物存在显著的方法学异质性和缺乏前瞻性多中心验证的问题。血浆中皮摩尔浓度CitH3的检测使其能够作为研究用检测在多项临床和实验研究中应用[25]。然而，该领域在DNA和核小体酶联免疫吸附测定法（ELISA）与游离肽ELISA之间存在分歧，……

## 免疫测定平台

尽管免疫测定法仍然是测量癌症队列中循环瓜氨酸化的主力方法，但当前平台的系统性比较表明仍存在分析碎片化问题，目前阻碍了跨研究解读和常规临床应用。最广泛使用的CitH3类型为核小体捕获夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA），这是一种研究用检测配置，可产生皮摩尔灵敏度，工作范围适合……

## 分析前考量与标准化

许多已知的血清/血浆生物标志物从分析和临床角度来看比循环瓜氨酸化蛋白更为成熟。它们面临着限制生物标志物在血浆或血清中使用的分析前问题，例如缺乏不同分析物的标准化程序、认证参考物质和外部质量评估（EQA）方案。一个关键因素是，已发表的瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）、瓜氨酸化及基质……的浓度……

## 预后与治疗反应监测

自2020年以来，循环瓜氨酸化蛋白在肿瘤学领域用于预后和治疗反应监测的研究证据取得了长足进展；然而，由于检测方法异质性以及直接血浆数据与组织、转录组学和机制数据的混合使用，研究之间的定量解读较为困难。治疗前血浆或血清中NET相关测量与预后或治疗反应的关联已在个体临床……中报道。

## 挑战与未来研究重点

该领域的一个关键问题是，尽管对底层生物学和细胞来源的理解日益加深，但循环瓜氨酸化蛋白的癌症特异性和背景依赖性效应仍然定义不清。瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）、瓜氨酸化及基质金属蛋白酶降解的波形蛋白（VICM）和肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）在研究环境中可定量测量，但尚未得到充分表征或跨血清……再现。

## 结论

过去，瓜氨酸化不过是翻译后修饰中的一个冷门现象；如今，这一现象可能成为肽基精氨酸脱亚胺酶（PAD）活性与中性粒细胞产生的胞外陷阱（NETs）之间的连接纽带，涉及组蛋白的瓜氨酸化和瓜氨酸化肿瘤新抗原的产生。这些过程与侵袭、转移、免疫逃逸以及对免疫检查点治疗的反应相关；然而，其方向性和程度具有肿瘤类型依赖性……

## 生成式AI声明

作者声明不存在利益冲突。在准备本文期间，作者仅使用生成式AI和AI辅助工具来改善稿件的语言、语法和可读性。未使用AI工具生成实质性内容、进行数据分析、解释结果或得出科学结论。

## CRediT作者贡献声明

Asma B. Omer：撰写 – 审阅与编辑，可视化。Shakir Saleem：数据整理，概念构思。Ruqaiyah Khan：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，软件。A. Rekha：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，概念构思。Rashmi Bhavasar：撰写 – 初稿，可视化，验证，软件。

## 利益冲突声明

作者声明不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

## 致谢

作者向诺拉·宾特·阿卜杜勒拉赫曼大学致以诚挚的感谢，感谢该校通过研究者支持项目（编号：PNURSP2026R854）资助了本研究，地点为沙特阿拉伯利雅得。作者感谢诺拉·宾特·阿卜杜勒拉赫曼大学提供的资源和设施，使本综述的编写成为可能。

Asma B. Omer | Shakir Saleem | Ruqaiyah Khan | A. Rekha | Rashmi Bhavasar