小细胞外囊泡介导铜钯纳米粒子形成及其增强纳米酶活性：机器学习辅助光电化学生物传感

《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Small extracellular vesicles-mediated formation of CuPd nanoparticles with boosted nanozyme activity: Machine learning-assisted photoelectrochemical biosensing

　　

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  具有双重身份的小细胞外囊泡（sEVs）触发铜钯纳米颗粒（CuPd NPs）的形成并增强纳米酶活性。
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  基于双重身份sEVs的光电化学（PEC）生物传感器的检测限为10个颗粒/μL。
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  机器学习辅助的PEC生物传感器可区分癌症患者与健康个体。

引言

小细胞外囊泡（sEVs）是一类由几乎所有活细胞分泌的纳米级膜囊泡，携带丰富的源自母细胞的肿瘤特异性生物分子信息 [1], [2]。此外，sEVs在外周血中表现出优异的稳定性，且对肿瘤病灶识别具有高特异性，使其成为早期肺癌筛查和辅助诊断的理想候选标志物 [3], [4]。由于癌症早期sEVs含量较低，传统检测方法（如Western印迹和酶联免疫吸附测定）灵敏度有限，且需要大量样本才能报告平均结果 [5], [6]。然而，这些技术瓶颈阻碍了sEVs的临床应用。

近期研究已证实sEVs具有独特的固有结构和生化特性 [7], [8]。具体而言，sEVs膜蛋白上丰富的酪氨酸糖基化位点和酚羟基可作为末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）核心催化中心的高效底物，触发sEVs表面的原位DNA聚合，消除了常规TdT扩增对DNA 3'-OH末端的依赖，简化了核酸设计的复杂性 [9], [10]。作为高性能双金属纳米酶，铜钯纳米颗粒（CuPd NPs）得益于Cu和Pd的间金属电子协同效应，具有优异的类过氧化物酶活性 [11], [12], [13], [14], [15]。其粒径小，可暴露充足的表面催化位点，并具有良好的生物相容性 [16], [17], [18]。将CuPd纳米酶与sEVs触发的原位TdT扩增相结合，为sEVs的高灵敏检测提供了一种新技术。

光电化学（PEC）生物传感器因背景信号低、灵敏度高且仪器简单，在生物标志物检测领域受到广泛关注，在早期肿瘤诊断方面展现出巨大的应用潜力 [19], [20], [21], [22], [23]。PEC生物传感器的性能高度依赖于信号放大策略，高效多功能信号放大的发展是实现痕量生物标志物高灵敏检测的关键 [24], [25], [26], [27]。此外，传统PEC方法依赖于孤立的 photocurrent 信号，无法充分利用多维感知信息 [28], [29]。机器学习在多维特征提取方面具有卓越能力，可将多次PEC读数、sEVs水平与临床数据相关联，建立可靠的癌症分类模型 [30], [31], [32], [33]。将机器学习与PEC生物传感器结合，可实现对低丰度sEVs弱信号的智能识别，显著提高癌症早期诊断的准确性 [34], [35]，从而为sEVs的智能检测提供新平台。

本文构建了一种集成机器学习算法的新型PEC生物传感平台，用于高灵敏检测肺癌来源的血浆sEVs，其核心在于sEVs在TdT催化反应和纳米酶活性增强方面的双重功能创新（图1）。得益于sEVs的膜蛋白，TdT触发的原位polyT延伸成功介导了sEVs-polyT-CuPd NPs的合成 [9]。此外，sEVs作为天然活性调节剂，显著增强了CuPd NPs的类过氧化物酶催化能力，实现了优异的催化沉淀效率，从而显著降低壳聚糖改性二氧化钛纳米颗粒（CTiO₂ NPs）的光电流。该PEC生物传感器通过EpCAM适配体（Apt）介导特异性捕获肿瘤来源的sEVs，实现了对sEVs的高灵敏检测。基于高性能的PEC检测结果，通过整合肺癌患者的血浆sEVs水平和多维临床数据，建立了机器学习模型，实现了对肺癌患者与健康个体的智能鉴别。基于sEVs在TdT反应启动和纳米酶催化放大中的双重调控功能，本研究将PEC生物传感器与机器学习算法相结合，用于肺癌早期辅助诊断，为sEVs分析和机器学习智能诊断提供了创新思路。

各节摘要

材料

材料和仪器、细胞培养及sEVs分离、CTiO₂ NPs的合成详见补充信息。

sEVs-polyT-CuPd NPs的制备

首先，将sEVs分散在含有4 μL TdT酶和10 μL 2 mM dTTP的20 μL反应缓冲液中，在37°C下温和振荡孵育1小时。反应结束后，通过超滤管对sEVs-polyT进行过滤和浓缩。然后，将100 μL sEVs-polyT加入80 μL 10 mM CuSO₄和160 μL PBS缓冲液中，温和振荡孵育1小时。之后

材料表征

通过扫描电子显微镜（SEM）图像对制备的Ti-MOF、TiO₂和CTiO₂ NPs的形貌进行表征。图1a显示Ti-MOF为带有片状突起的球形颗粒，粒径为350 nm。煅烧后，TiO₂ NPs保持了原始的球形轮廓，但表面呈现粗糙的颗粒状且粒径减小（图1b），这是由于有机配体骨架的分解和晶粒再结晶所致 [36], [37]。当

结论

综上所述，基于sEVs触发的CuPd NPs的原位形成及其纳米酶活性的增强，本研究开发了机器学习辅助的PEC生物传感器，用于血浆sEVs的高灵敏分析和癌症智能诊断。固定化的CuPd纳米酶可催化沉淀物形成，抑制CTiO₂ NPs的光电流，实现检测限低至10个颗粒/μL的sEVs痕量检测。结合机器学习，该PEC平台实现了令人满意的

知情同意与患者信息

所有参与者或其法定代理人均已签署书面知情同意书，同意参与本研究并发表相关论文。参与者的隐私权得到了保护。

人体研究

本研究在研究所在地遵守相关法律法规、监管框架和指导方针进行。

本研究已通过郑州大学生命科学伦理审查委员会的审批。

（批准编号：ZZURIB G2R2021-126）

病例报告

本研究遵循CARE指南。

CRediT作者贡献声明

耿文超：撰写原稿、方法论、调查研究、资助获取、形式分析、数据整理。王可晴：形式分析、数据整理。张梓然：形式分析、概念构思。张智杰：调查研究、形式分析。严志毅：数据整理、概念构思。李思龙：验证、软件。杨瑞莹：撰写审阅与编辑、监督、项目管理、资助获取。刘思宇：调查研究、数据整理。

利益冲突声明

作者声明，不存在已知可能影响本文所述工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本工作得到国家自然科学基金委员会（22404042、22104134）、河南省自然科学基金（252300423221）、河南省科技计划项目（262102321001）和河南省科学技术协会青年人才支持计划（2026HYTP063）的资助。

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