从活性氧到细胞器应激与先天免疫：干眼病中的氧化还原检查点网络

《Oxygen》：From Reactive Oxygen Species to Organelle Stress and Innate Immunity in Dry Eye Disease

　　

干眼病是一种复杂的多因素疾病，其中氧化应激日益被认为是眼表功能障碍的反复特征，也是连接环境应激、细胞器功能障碍、先天免疫和程序性细胞死亡的信号枢纽。线粒体和内质网功能障碍、内源性抗氧化系统失效以及活性氧（ROS）产生增加，可响应泪液高渗、干燥应激、衰老和其他损伤而发生。这些变化激活了诸如Nrf2/Keap1、SIRT3-TXNIP-NLRP3和SLC7A11/GPX4等氧化还原敏感性信号通路，将线粒体损伤和脂质过氧化与炎症小体激活、铁死亡、焦亡和上皮屏障破坏联系起来。泪膜损伤导致持续性炎症，进一步损害眼表。本叙述性综述通过氧化还原检查点的视角而非单一致病机制来审视干眼病中的氧化应激。研究人员整合了关于细胞器应激、抗氧化信号传导、先天免疫激活和程序性细胞死亡的最新证据，并讨论了它们之间的相互串扰，以强调治疗上可干预的节点。研究人员重点探讨了较新的氧化还原调节和线粒体靶向策略，同时批判性地考虑了临床前证据的过度代表性、氧化生物标志物验证的局限性，以及目前阻碍基于机制的抗氧化疗法进入具有不同临床表型的干眼病患者常规临床护理的转化障碍。

1. 引言

干眼病被重新定义为一种多因素、症状性疾病，其特征是泪膜和/或眼表稳态丧失。其病因因素包括泪膜不稳定和高渗、眼表炎症与损伤以及神经感觉异常。流行病学证据表明，高龄以及全身性、眼部、医源性和生活方式相关因素是主要风险因素。人体研究显示泪腺随年龄发生结构和功能改变，而实验性衰老模型则表现出炎性浸润和氧化损伤标志物的积累。然而，许多连接衰老、氧化损伤与眼表功能障碍的机制联系主要得到动物数据的支持。环境暴露也存在类似的证据梯度。一项包含102项临床前和临床研究的系统评价发现，颗粒物及其他污染物在细胞和动物模型中诱导氧化和炎症信号传导、凋亡及眼表损伤，但临床研究主要支持污染暴露与眼部刺激、结膜炎和干眼病相关体征之间的关联，而非建立特定的人体氧化还原机制。在此异质性背景下，氧化应激作为干眼病眼表环境的特征而非普遍性始动原因得到了更好的支持。一项系统评价和荟萃分析纳入了333例干眼病患者和165例健康对照，发现干眼病中氧化应激标志物总体升高，但研究间存在显著异质性。该信号在泪液和结膜样本中均可观察到，包括4-羟基壬烯醛、丙二醛和ROS水平升高。值得注意的是，个体生物标志物不应被视为可互换的。对44例非舍格伦干眼病患者和33例对照的研究发现，泪液4-HNE和MDA在患者中更高，而早期脂质过氧化标志物己酰赖氨酸则基本相似。进一步分析发现，4-HNE和MDA与泪膜破裂时间、Schirmer值、泪液清除率、角膜上皮病变、结膜杯状细胞密度及症状相关，而HEL则无此关联。氧化环境之所以在机制上重要，不仅是因为直接的生物大分子损伤。生理浓度的ROS参与细胞信号传导，而过量的ROS则可氧化脂质、蛋白质和核酸，扰乱细胞内稳态。线粒体是ROS的重要内源性来源，线粒体功能障碍可进一步增强ROS的产生。其他ROS来源包括内质网和一些酶系统，如NADPH氧化酶和黄嘌呤氧化酶。氧化损伤也可能与先天免疫信号相互作用。ROS介导的膜和细胞器损伤可能产生损伤相关信号，触发包括NLRP3相关信号在内的炎症通路反应。然而，大部分机制证据仍处于临床前阶段。抗氧化反应是被主动调控而非被动发生的。Nrf2/Keap1系统协调转录水平的抗氧化防御，并与硫氧还蛋白/TXNIP信号及SLC7A11依赖性氧化还原调节相互作用。但是，支持药物调控这些通路的干眼病文献仍然主要由细胞和动物实验主导，尚缺乏针对Nrf2靶向机制的直接临床验证。人体炎症证据为该领域提供了重要的补充信息。一项对13项研究的荟萃分析显示，干眼病患者泪液中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ和TNF-α浓度高于对照组，但方法学差异和个体间变异性阻碍了可靠诊断阈值的定义。因此，氧化和炎症异常共存于人类干眼病中，但其相互作用的方向和分子中间体无法仅从观察数据推断。在本综述中，研究人员使用“氧化还原检查点”这一操作框架来描述决定氧化应激是被缓冲、修复还是转化为炎症和细胞死亡信号的分子系统。研究人员不将ROS积累视为单一的致病机制，而是探索环境或代谢应激如何与上皮功能障碍相关联。这涉及线粒体和内质网应激、Nrf2/Keap1和SIRT3-TXNIP相关的抗氧化控制、线粒体DNA依赖的先天免疫感应以及NLRP3炎症小体激活。随后，本文评估了程序性细胞死亡形式，特别是铁死亡、焦亡和坏死性凋亡，以考察其实验证据能否有意义地整合到当前的干眼病模型中。本综述着重强调区分已在患者中证实的机制与从细胞或动物模型推断的机制，识别组织和表型特异性差异，并确定哪些氧化还原通路和生物标志物有足够支持，可被视为合理的转化靶点，而非仅在机制上具有吸引力但尚未经证实。

3. 结果

3.1 氧化应激作为起始和放大信号

前述临床证据表明干眼病眼表存在氧化失衡，但未阐明ROS积累主要是上皮损伤的结果还是在疾病传播中发挥积极作用。机制研究通过显示ROS可作用于先天炎症信号上游而非仅仅是组织损伤的终产物来解决这一区别。一项重要的转化研究将高渗应激与人体角膜上皮细胞和环境诱导型干眼病患者中的ROS-NLRP3-IL-1β轴联系起来。暴露于高渗培养基后，ROS生成增加，这种增加以及NLRP3炎症小体形成、caspase-1活性和IL-1β释放可被N-乙酰半胱氨酸预处理抑制。沉默NLRP3可独立降低ASC、pro-caspase-1和pro-IL-1β表达，并减少caspase-1活性和IL-1β分泌。这些发现共同表明在该实验系统中ROS位于炎症小体激活的上游。值得注意的是，同一研究纳入了20例环境诱导型干眼病患者和15例对照，结果显示结膜上皮ROS荧光增强，NLRP3、PYCARD、CASP1和IL1B转录本上调超过两倍，泪液生物活性IL-1β也升高。泪液IL-1β与OSDI评分正相关，与泪膜破裂时间负相关。因此，人体研究支持了实验中识别的相同信号组分的存在，尽管这仍是关联性的，无法确立其时间或因果顺序。在干燥应激模型中研究了该反应的时间结构。暴露于低湿度和东莨菪碱诱导的泪液抑制仅24小时后，角膜上皮NF-κB磷酸化p65、核NF-κB、NLRP3蛋白和Nlrp3转录本以及caspase-1染色均已增加。这种早期反应并非炎症细胞因子转录的普遍上调：IL-1β mRNA在第1天下降，而结合的IL-18和总IL-18蛋白增加，成熟的IL-1β随后在第1至5天之间增加。这些发现支持在完全积累下游成熟细胞因子之前，上皮固有通路即已早期激活。更近期的研究在高渗性与炎症小体激活之间增加了一个机械敏感步骤。暴露于高渗培养基增加了PIEZO1以及NLRP3和IL-1β，促进了NF-κB核转位和IκBα磷酸化，并增加了ASC斑点形成和成熟IL-1β p17片段。用Yoda1激活PIEZO1重现了NLRP3激活，而沉默PIEZO1以及用Dooku1或GsMTx4进行药理抑制则抑制了高渗诱导的炎症小体反应。在相应的东莨菪碱小鼠模型中，局部PIEZO1抑制也减弱了炎症小体激活并改善了受损的角膜表型。总之，这些发现细化了氧化应激在干眼病中的作用。ROS不仅可被解释为脂质、蛋白质和DNA氧化的标志物，也可被视为压力传感网络的组成部分。该网络能够将渗透压和干燥刺激转化为先天炎症反应。尽管如此，细胞和动物模型通过ROS抑制、NLRP3敲低和PIEZO1操作提供了最强的因果证据。人体数据显示了通路激活的一致性，但这种序列尚未被证明在所有干眼病表型中统一运作。

3.2 内质网应激与未折叠蛋白反应

相同的信号逻辑同样适用于内质网稳态的上游。当错误折叠蛋白积累时，未折叠蛋白反应最初有助于降低蛋白质合成并增加折叠能力。但当内质网应激无法解决时，UPR信号可转向炎症和促凋亡通路。这一概念在干眼病中得到有限的人体证据以及更详细的实验数据支持。近期研究表明UPR与上述氧化和炎症小体通路之间存在分子联系。对从泪腺切除干眼病小鼠和对照小鼠分离的角膜上皮细胞进行单细胞RNA测序，揭示了内质网应激和末端UPR特征的富集，特别是GRP78增加和PERK-CHOP分支的激活。研究人员后来在东莨菪碱/干燥应激模型以及暴露于高渗培养基的原代和水生化人角膜上皮细胞中重复了这些结果。通过4-苯基丁酸药理性减少内质网应激，降低了高渗性诱导的ROS产生和NLRP3/IL-1β激活，而衣霉素诱导内质网应激则增加了TXNIP的表达。敲低EIF2AK3降低了p-eIF2α、ATF4、CHOP和TXNIP的水平，而沉默TXNIP则减少了NLRP3、pro-IL-1β和裂解的IL-1β；相反，过表达TXNIP增强了这些炎症小体相关信号。来自舍格伦综合征相关干眼病患者的眼表样本中存在内质网应激的直接证据。与女性对照相比，患有舍格伦综合征且牛津眼表染色分级≥III的女性患者的结膜印迹细胞学显示，结膜上皮细胞中HSPA5/GRP78的定位改变和促凋亡UPR介质DDIT3/CHOP的积累。在互补的分层人角膜上皮模型中，暴露于高渗盐水产生了浓度和时间依赖性的UPR激活：sXBP1表达在24小时达到峰值，额外暴露于94 mM NaCl 24小时显著增加了HSPA5和DDIT3，伴随上皮细胞丢失和玫瑰红阳性损伤。在同一模型中的干预支持内质网应激的功能性而非仅仅是关联性作用。加入化学伴侣牛磺熊去氧胆酸显著减少了高渗性诱导的细胞丢失，减轻了核染色质浓缩、DNA断裂和caspase-3裂解。在高渗条件下，TUDCA还选择性降低了炎症介质CXCL8和IL5的转录。这些发现提供了维持内质网蛋白质稳态可改变上皮存活和炎症输出的原理证明。然而，该干预是在体外而非作为干眼病患者的治疗方法进行测试的。因此，这些实验将内质网应激定位于PERK-CHOP-TXNIP-NLRP3信号序列的上游，该序列能够将蛋白质稳态缺陷与ROS生成和先天炎症耦合起来。然而，证据等级很重要。人体眼表证据目前仅限于一个非常小且临床特异的舍格伦队列，而对PERK、TXNIP、ROS和NLRP3的因果操作均在实验系统中进行。目前，内质网应激标志物不能被视为定义干眼病内型或预测对内质网导向治疗反应的经过验证的生物标志物。

3.3 线粒体功能障碍、mtDNA释放与线粒体自噬

线粒体将氧化还原反应的范围扩展到ROS积累之外，因为线粒体功能的变化可同时影响细胞能量代谢、氧化还原平衡和线粒体危险信号的可用性。围绕干眼病的实验文献将高渗及其他眼表应激与线粒体膜电位变化、ATP生成减少、线粒体结构和钙稳态破坏以及线粒体ROS增加联系起来，为线粒体功能障碍与氧化损伤之间的自我强化关系提供了机制基础。然而，现有证据大多基于细胞和动物研究，而非对干眼病患者线粒体功能的直接测量。近期实验开始描绘线粒体氧化还原紊乱如何与炎症信号耦合。在水生化HCE-T人角膜上皮细胞中，高渗性增加了mtROS，降低了线粒体膜电位和ATP产生，并产生了肿胀和碎片化的线粒体，伴有嵴破坏和基质稀疏。过表达SIRT3逆转了这些异常，而用3-TYP药理性抑制SIRT3则进一步增加了mtROS并加剧了膜电位和ATP产生的丧失。同样的操作影响了炎症输出：高渗应激降低了硫氧还蛋白，增加了TXNIP、NLRP3、裂解的caspase-1、IL-1β和IL-18，而SIRT3过表达则产生相反效果。暴露于苯扎氯铵的小鼠从第8至14天同时接受局部和厚朴酚治疗，同样改善了线粒体超微结构，减少了角膜ROS，并减弱了TXNIP-NLRP3信号。因此，这些实验支持线粒体功能障碍下游的mtROS-TXNIP-NLRP3序列。然而，证据仍属临床前，该研究未评估干眼病患者中的SIRT3激活。亚细胞水平上氧化损伤的来源很重要，线粒体靶向的证据表明了这一点。在H₂O₂应激的人角膜上皮细胞中，暴露于300 μM H₂O₂后，总细胞内ROS和mtROS分别增加约4.3倍和2.7倍。线粒体靶向SkQ1纳米颗粒显示出比游离SkQ1更强的胞质和线粒体ROS清除活性，并能更好地维持线粒体膜电位。值得注意的是，氧化应激导致8-OHdG阳性的线粒体DNA氧化、氧化mtDNA的胞质释放以及ox-mtDNA与NLRP3的共定位。SkQ1纳米颗粒显著减少了这些事件。在BAC诱导的干眼病模型中局部应用SkQ1纳米颗粒也降低了NLRP3、caspase-1和IL-1β的表达，同时减少了mtDNA氧化。因此，这些发现将线粒体ROS不仅与广泛的氧化损伤联系起来，还与能够激活炎症小体的mtDNA衍生信号的产生联系起来。释放的mtDNA的另一种命运是被环GMP-AMP合酶-干扰素基因刺激因子通路识别。在高渗应激的水生化人角膜上皮细胞中，胞质mtDNA增加，伴随cGAS-STING活性增强。沉默CGAS或TMEM173减少了TBK1和IRF3磷酸化以及下游CXCL10和IFN-β的表达。转染分离的mtDNA重现了通路激活。相反，用溴化乙锭将细胞mtDNA降低约50%减弱了STING、p-TBK1、p-IRF3、CXCL10和IFN-β反应。机制上，高渗应激诱导线粒体结构损伤和线粒体通透性转换孔开放。用环孢菌素A抑制mPTP开放减少了胞质mtDNA和cGAS-STING信号；然而，BAX敲低没有可比效果。阻断氧化mtDNA并未抑制cGAS-STING激活。总之，这些发现支持在该实验系统中胞质mtDNA移位在cGAS-STING激活中的作用，而非将其确立为唯一或决定性的关键信号。重要的是，同一研究还包括了26例干眼病患者和22例对照，并证明在用Schirmer试纸收集的泪液样本中cGAS和STING蛋白水平升高；STING水平与角膜荧光素染色呈正相关。这与上述ox-mtDNA-NLRP3相互作用不同，表明mtDNA可根据其亚细胞定位和分子状态参与不同的先天传感器。然而，这种解释源于对不同实验系统的比较，而非直接的面对面研究。额外的人体观察进一步支持cGAS-STING的转化相关性。在随后对环境性干眼病的研究中，高渗应激的原代人角膜上皮细胞和环境性干眼病小鼠模型均显示cGAS、STING、TBK1、IRF3和IFN-β增加。在小鼠模型中，STING抑制也减少了炎症介质和角膜上皮损伤。更重要的是，来自11例干眼病患者和11例对照的结膜样本显示五个通路组分的表达均显著增加。这些发现提供了通路激活的人体验证，但仍属横断面研究且基于小样本量。早期工作曾提出cGAS-STING是干眼病中可能的DNA感应机制，当时的直接实验证据尚未获得。目前的发现使该通路超越了最初的假说阶段，但尚未建立由cGAS-STING定义的临床内型或STING导向治疗在患者中的疗效。现有的PINK1/Parkin数据不支持增加线粒体自噬具有一致有益效果的结论，线粒体质量控制为此情况增添了另一层复杂性。在人角膜上皮细胞中，暴露于BAC产生了剂量依赖性的氧化和线粒体损伤。进一步的机制实验使用了较低浓度的BAC，该浓度增加了细胞内和线粒体ROS，降低了膜电位、ATP、谷胱甘肽氧化还原平衡和超氧化物歧化酶活性，并增加了丙二醛。此外，该浓度BAC将线粒体动力学转向DRP1/Fis1介导的裂变，并触发了PINK1/Parkin相关的线粒体自噬流。去甲肾上腺素减少了ROS，改善了线粒体功能和活力，并降低了BAC诱导的线粒体自噬反应指标。在BAC处理的小鼠中也观察到了角膜染色、TUNEL阳性、线粒体碎片化、ROS、TNF-α和IL-1β的相应改善。因此，在该模型中，保护作用与限制过度的线粒体自噬反应相关，而非进一步增加它。相比之下，在另外两个实验环境中，PINK1依赖性线粒体自噬是保护所必需的。在高渗应激的人角膜上皮细胞中，cRGD缀合的胆红素纳米颗粒减少了ROS、NOX4、4-HNE和炎症细胞因子，并改善了线粒体呼吸、膜电位、生物发生和动力学。PINK1敲低在很大程度上消除了这些线粒体、抗氧化和抗炎益处。在BAC诱导的干眼病小鼠模型中，局部使用cNPs@BR治疗7天降低了角膜荧光素评分并增加了泪液分泌。此外，该治疗增加了角膜PINK1、Parkin和LC3B，并降低了p62。类似地，在12月龄小鼠中，衰老与泪腺氧化应激、线粒体功能障碍和腺泡细胞凋亡相关。用雷帕霉素增强PINK1/Parkin相关线粒体自噬改善了泪腺结构和泪液分泌，同时减少了ROS和凋亡。用Mdivi-1抑制则增加了纤维化和炎性细胞浸润，增加了TUNEL阳性细胞，并损害了线粒体清除和腺体功能。总之，这些看似矛盾的结果表明，线粒体自噬不应被视为固有有益或有害的通路。相反，它们支持一个模型，即线粒体质量控制在促进功能失调细胞器的有效清除时是适应性的，但在严重受损的线粒体群体中被强烈或持续激活时，可能伴随或促成损伤。因此，治疗调节的方向很可能取决于起始应激、组织区室、线粒体损伤负荷和自噬流状态。至关重要的是，所有三项研究均为实验性的，目前尚不清楚改变的线粒体自噬是否定义了人类干眼病中可重复的表型。

3.4 抗氧化系统作为氧化还原检查点

前述发现表明，抗氧化防御最好被视为一系列调节阈值，而非简单地与ROS产生相对抗。核因子E2相关因子2在转录水平给出了最清晰的例子。在基础条件下，Kelch样ECH相关蛋白1促进Nrf2降解。在氧化应激下，这种调节被破坏，导致Nrf2积累、转位到细胞核、与小Maf蛋白结合以及依赖抗氧化反应元件的转录。下游程序包含了多种细胞保护基因，包括血红素加氧酶-1、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等。除了这些经典酶类，Nrf2调控还涵盖了一组额外的靶基因。据报道，该通路可增加硫氧还蛋白表达，抑制TXNIP，并诱导胱氨酸/谷氨酸转运体SLC7A11/xCT，从而将转录水平的抗氧化适应与上述几个氧化还原敏感系统联系起来。然而，专门针对干眼病的证据大多是实验性的。缺乏Nrf2的小鼠在暴露于环境应激后比野生型动物经历更多的眼表氧化损伤，而几种药理学Nrf2激活剂可减少氧化标志物并改善实验性干眼病表型。更近期的研究提供了这个更广泛网络的一个例子：cNPs@BR在高渗应激的角膜上皮细胞中升高了核Nrf2和HO-1，同时降低了ROS、NOX4和4-HNE水平。然而，同一干预也影响了NF-κB信号和PINK1依赖性线粒体自噬，排除了将其全部效应仅归因于Nrf2的可能性。关键的是，现有关于Nrf2导向治疗的综述未发现直接验证Nrf2激动剂在干眼病中疗效的临床试验，并强调Nrf2/Keap1与其他信号通路之间的相互作用仍未完全明确。基于本综述采用的框架，Nrf2/Keap1可被视为一个转录氧化还原检查点，而SIRT3和PINK1/Parkin依赖性线粒体质量控制则更接近细胞器本身运作。此术语仅用于本文的操作目的，并非正式公认的分子分类。同样重要的是，不要超出现有证据所示：尽管有报道称SLC7A11/xCT受Nrf2调控，但这些数据本身并未在干眼病中建立临床上相关的SLC7A11-GPX4铁死亡检查点。因此，连接脂质过氧化物解毒与铁死亡细胞死亡的证据将在程序性细胞死亡部分单独考虑，而非从此处呈现的抗氧化研究中推断。

3.5 先天免疫感应作为细胞器应激向炎症转化的转换器

综上所述，上述研究将先天感应确定为不同类型细胞应激可获得共同炎症输出的关键节点。研究最多的汇聚节点是NLRP3。NLRP3激活已在实验上与高渗性诱导的ROS、PIEZO1依赖性机械感应、内质网应激期间的PERK-CHOP/TXNIP信号以及线粒体mtROS-TXNIP信号联系起来。线粒体损伤通过胞质ox-mtDNA与NLRP3相互作用提供了另一条途径。尽管如此，这些机制不应被表述为一条单一的经验证实的线性通路。它们是在各种模型中使用不同扰动建立的。然而，尚无研究显示所有这些上游信号在单个干眼病患者中同时运作，或它们具有同等重要性。当NLRP3与cGAS-STING比较时，这一区别尤为相关。两种通路都有能力将线粒体损伤转化为炎症。然而，可用的实验数据表明了不同形式的线粒体信号。在SkQ1纳米颗粒的研究中发现，释放到细胞质中的氧化mtDNA与NLRP3共定位。在阻止mtDNA氧化和释放后，炎症小体激活减弱。相反，在高渗应激下cGAS-STING的激活依赖于mPTP介导的mtDNA泄漏到胞质中，而实验性干扰mtDNA氧化并未抑制该通路。cGAS-STING随后主要通过TBK1-IRF3和I型干扰素相关介质发出信号，而非通过caspase-1依赖性细胞因子成熟。因此，线粒体破坏似乎并不只有一个先天免疫后果；线粒体来源的危险信号的位置和分子状态可能影响哪个感应系统被激活。这些通路的临床支持强度也有所不同。ROS-NLRP3轴具有一致的人体眼表证据，尽管其因果顺序主要来源于细胞实验。对于cGAS-STING，两个独立的人体队列使用不同的眼表样本和分析方法提供了趋同证据。在一项研究中，26例干眼病患者的泪液cGAS和STING蛋白水平高于22例对照，且STING水平与角膜荧光素染色正相关。另一项独立研究证明了11例环境性干眼病患者与11例对照相比，结膜中cGAS、STING、TBK1、IRF3和IFN-β的上调。这些观察结果加强了cGAS-STING通路激活发生在人类干眼病中的证据，尽管现有研究仍为横断面设计，未能建立通路依赖性、在不同干眼病表型中的患病率或预测价值。因此，cGAS-STING最好被视为一个经实验证实并获得趋同人体验证的通路，而非一个经过验证的分子内型。

3.6 程序性细胞死亡：铁死亡、焦亡和坏死性凋亡

程序性细胞死亡是一个执行层面，通过它，氧化还原失衡、细胞器应激和炎症信号可转化为眼表上皮细胞的丢失。根据干眼病文献，几种部分重叠的死亡程序被牵涉其中，包括焦亡、铁死亡和坏死性凋亡，但不同证据线的稳健性存在差异。对人泪液和结膜的检测已发现了焦亡相关组分，包括NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18。这些发现提供了临床验证，表明与炎症小体相连的死亡机器存在于病变的眼表。然而，此类测量无法证明体内溶解性上皮死亡的发生、程度或相对贡献。铁死亡和坏死性凋亡的机制证据甚至更集中在应激上皮细胞和实验动物模型中。因此，这些通路应被解释为实验支持的上皮损伤机制，而非已确定的、相互排斥的临床干眼病分子内型。对于焦亡而言，相关进展不仅仅是NLRP3激活的进一步证据，而是展示了多样化的上游信号和gasdermin执行者如何将炎症小体活性转化为膜破裂。钾外流提供了这样一个切入点。在角膜上皮细胞中，尼日利亚菌素降低了细胞内钾并增加了细胞死亡，伴随NLRP3、ASC、裂解的caspase-1和N端GSDMD；用奎宁抑制钾外流减弱了这些变化。干燥应激在HCE-T细胞中产生了类似表型，而沉默KCNK5保留了细胞内钾，减少了细胞死亡以及IL6、IL1A和IL1B的mRNA水平，并抑制了NLRP3/caspase-1/GSDMD信号。东莨菪碱/干燥应激小鼠显示了类似结果，沉默KCNK5减少了角膜上皮缺损和焦亡相关蛋白，并部分恢复了泪液分泌。转录组学和功能实验进一步将KCNK5与TNFSF10相关自噬活性降低联系起来，补充TNFSF10缓解了焦亡表型。因此，离子流和自噬能力似乎能够改变炎症小体依赖性上皮裂解的阈值，而非构成不同的致病过程。焦亡的执行不限于GSDMD。当人角膜上皮细胞暴露于312-500 mOsm的高渗条件时，膜破裂伴随着caspase-3和GSDME的增加，且在沉默GSDMD时GSDME表达增加。在经受实验性干眼病的GSDMD敲除小鼠中，尽管未检测到PARP相关凋亡，caspase-3仍增加，而GSDME和焦亡相关炎症标志物保持升高。这些结果支持在缺乏经典GSDMD依赖性执行的情况下存在替代的caspase-3/GSDME途径，并警告不要简单地将该实验背景下的caspase-3活性等同于凋亡。相比之下，经典的NLRP3/caspase-1/GSDMD轴在BAC大鼠模型中强烈激活：与健康对照相比，NLRP3、caspase-1、GSDMD和IL-1β分别增加了约6.2倍、5.9倍、8.8倍和10.3倍。给予游离褪黑素相对于盐水处理的BAC眼将这些信号降低了22%、31%、42%和26%，而TAT修饰的褪黑素脂质体导致了更大的抑制，同时减少了mtDNA氧化并保护了角膜上皮和结膜杯状细胞。由于该干预同时靶向线粒体氧化损伤和炎症小体信号，其治疗效果不能特异性地归因于焦亡抑制。铁死亡是氧化还原检查点框架最直接的机制延伸，因为细胞死亡发生在铁依赖性脂质氧化超过抗氧化和脂质修复系统能力之时。高渗角膜上皮细胞和东莨菪碱/干燥应激模型中的铁死亡表型已通过细胞内Fe²⁺积累、脂质过氧化、GPX4和铁处理蛋白的改变以及特征性线粒体损伤来定义。这种反应不仅仅是ROS增加所致；应激细胞同时激活保护程序。AKR1C1在NRF2下游被诱导，选择性耗竭AKR1C1导致细胞活力下降、脂质过氧化增加、GPX4、FTL和FTH1降低以及TFRC增加。相反，过表达AKR1C1既减少了脂质过氧化也减少了细胞内铁积累。这提供了转录抗氧化反应与氧化应激进展为铁死亡可能性之间的功能联系。GPX4作为一个反复出现的汇聚点，但通过不止一条调节途径。在高渗角膜上皮细胞中，虾青素增加了SLC7A11和GPX4的水平，改善了谷胱甘肽可利用性和铁蛋白相关的铁储存，减少了Fe²⁺超载、ROS和脂质过氧化，并保持了线粒体结构。Ferrostatin-1和去铁胺也显示了相关的抗铁死亡效应，并伴随自噬流的恢复。膜脂对铁死亡的易感性提供了另一个调节轴。在BAC处理的大鼠中，角膜脂质氢过氧化物水平比对照高43.7%。此外，局部抑制DDR1减少了脂质过氧化和ACSL4表达。在高渗应激的人角膜上皮细胞中，脂质过氧化物阳性细胞约有六倍升高。DDR1-IN-1以浓度依赖性方式保护细胞，而过表达YAP1基因或重新激活YAP则降低了这种保护。这支持了一个DDR1-YAP-ACSL4机制，而非对铁摄取的普遍效应。自噬功能障碍可汇聚于同一个脂质重塑酶。在干燥应激下，自噬流受损与SQSTM1积累相关。此外，SQSTM1过表达增加了ACSL4、Fe²⁺、ROS、丙二醛和4-HNE，同时降低了细胞活力和GPX4。沉默ACSL4逆转了这些改变。用罗格列酮在体内抑制ACSL4减少了角膜上皮缺损，但泪液分泌和结膜杯状细胞的恢复未达统计学显著性。这一区别很重要：抑制分子铁死亡标志物和改善上皮染色不一定反映整个泪腺功能单位的恢复。SIRT1是一条独特的GPX4调节通路的一部分。当人角膜上皮细胞暴露于高渗培养基时，丙二醛和Fe²⁺增加，谷胱甘肽减少，脂质氧化增加，线粒体体积减小。用SRT1720激活SIRT1抑制了这些变化。机制上，HIF1α被SIRT1去乙酰化并稳定，而HIF1α反过来支持GPX4表达。SRT1720还增加了东莨菪碱诱导的干眼病小鼠角膜GPX4并减少了脂质氧化。总之，这些实验研究确定了可能改变脂质过氧化物易感性的多条途径。然而，没有一项研究证明这些通路的药理操作能改变人类干眼病。坏死性凋亡呈现出细胞死亡与炎症之间的不同关系，因为死亡机制本身可以反馈到先天感应。在干燥应激干眼病中，观察到RIPK3和MLKL增加。缺失RIPK3保护了角膜上皮，而局部过表达RIPK3则加重了上皮损伤。SQSTM1作用于RIPK3下游：沉默SQSTM1甚至在RIPK3过表达的细胞中也减少了MLKL和磷酸化MLKL，而过表达SQSTM1则增强了坏死性凋亡信号。这种活性与经典的自噬流无关，并且不同于上面在铁死亡中涉及的依赖自噬的SQSTM1积累。RIPK3缺失也导致NLRP3表达降低，而在NLRP3缺陷动物中RIPK3仍保持升高。这将该模型中的NLRP3置于RIPK3的下游。操纵SQSTM1同样改变了NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β。因此，坏死性凋亡可能通过活跃的细胞内信号以及在膜破裂后释放细胞内内容物来加剧炎症。另一种坏死性凋亡机制将线粒体动力学与细胞死亡联系起来。高渗应激诱导了角膜上皮细胞中的局部C5a-线粒体C5a受体1信号。随后，该过程激活DRP1，引起线粒体碎片化，继而发生RIPK3/MLKL依赖性坏死性凋亡。重组C5a暴露分别将线粒体平均分支长度、周长、长宽比和每个线粒体的分支数减少了46%、66%、32%和64%，同时使磷酸化DRP1增加了约50%。研究发现，用Mdivi-1抑制DRP1使磷酸化MLKL减少了43%，并将细胞活力提高了16%。这支持线粒体分裂作为功能性中间步骤而非伴随的形态学改变。细胞内C5aR1拮抗剂JPE-1375在抑制RIPK3/MLKL激活方面比膜不通透性拮抗剂PMX-53更有效，并在实验性干眼病小鼠中导致角膜染色评分降低约32%。这些发现为细胞内补体-线粒体-坏死性凋亡轴提供了机制证据，尽管该轴在人类上皮丢失中的重要性仍有待确定。相关的程序性细胞死亡发现也已由独立小组使用不同的实验模型报告。尽管如此，几个特定的机制轴仍由相对有限数量的实验室支持，需要更广泛的独立复制。最后，这些通路之间的划分可能并非固定不变。白杨素提供了一个有启发性的实验范例。在高达18 μM的非细胞毒性浓度下，白杨素减少了NOX2、4-HNE和FACL4/ACSL4，同时增加了GPX4。质粒介导的NOX2过表达逆转了其对ROS、Fe²⁺积累和脂质过氧化的影响。同时，白杨素减少了STING/NLRP3信号以及IL-1β和IL-6，这些效应在质粒介导的STING过表达后消失。这些实验显示了铁死亡和炎症信号的同时调节，但它们并未确立在干眼病中铁死亡本身激活了STING；白杨素的泛效性以及BAC模型排除了这种因果推断。新兴文献因此支持程序性细胞死亡是氧化还原、代谢、细胞器和炎症应激的网络化结果，而非一组孤立的终端通路。铁死亡尤其受到日益详细的分子实验支持，这些实验将铁处理、GPX4依赖性抗氧化防御、脂质重塑、自噬和线粒体功能联系起来。尽管如此，最近的转化评估承认，证据仍然由培养的上皮细胞和急性啮齿动物模型主导，这些模型无法再现人类干眼病的慢性、泪膜动力学、眨眼相关的机械应力、神经免疫相互作用或病因异质性。临床证据主要是观察性的，尚未展示铁死亡特异性的靶点参与或疾病改善。因此，对于临床干眼病而言，“中心驱动因素”之类的术语仍为时过早。更相关的转化问题可能是，在特定的组织、疾病表型和阶段中，哪种死亡通路成为上皮丢失的限速步骤，以及在对患者尝试通路导向治疗之前，能否前瞻性地识别出这种状态。在实验上，应使用分子和功能标准的组合而非单一标志物来区分这些死亡程序。焦亡由gasdermin裂解、炎症小体/caspase激活、膜通透化和成熟炎症细胞因子释放支持；铁死亡由铁依赖性脂质过氧化、GPX4/SLC7A11或ACSL4相关信号改变以及铁死亡抑制剂或铁螯合的功能性拯救支持；坏死性凋亡由RIPK3/MLKL激活以及对该轴的遗传或药理中断支持；凋亡则由特征性的凋亡形态和caspase/PARP相关信号在缺乏主要的溶解性gasdermin介导执行的情况下支持。没有单一标志物是完全特异的：例如，caspase-3可参与GSDME介导的焦亡而非经典凋亡。当前的干眼病模型支持这些通路之间存在大量串扰，包括RIPK3-NLRP3耦合以及铁死亡和炎症信号的同时调节，但它们并未确定在人类干眼病中不同的死亡程序是同时、顺序还是在不同的上皮细胞群中被激活。