靶向miR-21通过直接抑制Smad7/Ski恢复Th17/Treg平衡改善溃疡性结肠炎

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Targeting miR-21 ameliorates colitis by restoring Th17/Treg balance through direct inhibition of Smad7/Ski

　　

微小RNA-21（microRNA-21，miR-21）被认为与溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）发病机制相关，并被假设通过调控CD4⁺ T细胞分化参与疾病进展，尽管精确分子机制尚不清楚。研究人员利用临床样本和葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的小鼠结肠炎模型，发现miR-21在炎症组织中显著上调。在小鼠中，miR-21上调促进促炎性辅助性T（T helper，Th）2和Th17细胞分化，同时抑制抗炎性调节性T（regulatory T，Treg）细胞。研究人员鉴定Smad7和Ski——TGF-β（transforming growth factor-β，转化生长因子-β）通路的两个抑制因子——为miR-21的直接靶点。通过抑制这些靶点，miR-21激活磷酸化Smad2/3（phospho-Smad2/3）通路，从而驱动Th17/Treg失衡。在DSS处理小鼠中，miR-21 antagomir（miR-21拮抗剂）治疗性干预有效降低miR-21水平，恢复Smad7和Ski表达，抑制磷酸化Smad2/3激活，纠正T细胞失衡，并缓解结肠炎症状。研究人员的发现扩展了先前建立的miR-21-Smad7调控模型，通过鉴定Ski作为互补靶点，miR-21经其放大TGF-β信号并促进Th17/Treg失衡。这些结果为微小RNA（miRNA）介导的免疫失调提供了新的机制见解，并提示miR-21-Smad7/Ski轴作为潜在治疗靶点，尤其是在UC中。

一、研究背景与问题
炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）包括克罗恩病（Crohn’s disease，CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC），是一种慢性、免疫介导的胃肠道疾病，全球发病率上升。当前治疗策略包括免疫调节、细胞因子靶向生物制剂和肠道菌群干预，但仍有相当比例患者出现原发无应答或继发失去应答，因此需要深入探索疾病机制以开发新的防治策略。IBD发病涉及遗传易感性、环境因素和免疫失调的复杂相互作用。CD4⁺ T细胞亚群失衡是其关键环节，CD与Th（T helper，辅助性T）1反应相关，UC呈非典型Th2特征，Th17/Treg（regulatory T，调节性T）失衡近年受到重视。微小RNA（microRNA，miRNA）是基因表达和免疫稳态的转录后调节因子，具有生物标志物和治疗靶点潜力。其中，miR-21在IBD中失调，但表达水平和功能报道存在矛盾；在活化T细胞中显著上调，并参与调节T细胞活化和凋亡。临床研究显示，活动期UC患者CD3⁺ T细胞中miR-21表达高于缓解期患者。已有证据表明miR-21通过靶向Smad7促进Th17分化，但IBD中miR-21是否通过影响CD4⁺ T细胞分化推动疾病进展、涉及哪些靶基因网络（尤其Smad7之外的新靶点）以及具体调控机制尚不清楚。因此，研究人员系统评估炎症结肠组织中miR-21表达，分析临床IBD样本和DSS诱导结肠炎模型，分选naive CD4⁺ T细胞并干预miR-21，以阐明其靶基因网络和调控CD4⁺ T细胞分化的分子机制，并探索靶向miR-21治疗DSS诱导结肠炎的可行性。

二、关键方法
临床黏膜样本来自华中科技大学同济医学院附属同济医院，包括肠息肉对照、UC和CD患者，并按内镜活动分级。动物为SPF雄性C57BL/6小鼠，采用3%葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导急性结肠炎。关键技术包括：磁珠分选小鼠脾naive CD4⁺ T细胞，在Th1、Th2、Th17和iTreg（induced Treg，诱导型调节性T）极化条件下培养并转染miR-21 mimics/inhibitor及Smad7/Ski小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）；流式细胞术检测T细胞亚群；逆转录定量聚合酶链反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、Western blot、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）和免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）；双荧光素酶报告基因验证靶点；并用miR-21 antagomir进行体内干预。

三、研究结果
1. 结肠炎症中miR-21表达上调。通过临床样本RT-qPCR，活动期UC肠黏膜miR-21高于对照且高于活动期CD，并与内镜活动正相关；DSS小鼠出现体重下降、便血、疾病活动指数（disease activity index，DAI）升高、结肠缩短、H&E和髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）异常，结肠及脾淋巴细胞miR-21上调，PDCD4下调，FISH显示miR-21主要位于结肠固有层淋巴细胞（lamina propria lymphocytes，LPLs）和炎症浸润，并与黏膜损伤严重度相关。
2. DSS诱导急性结肠炎小鼠CD4⁺ T细胞亚群比例改变。通过RT-qPCR、ELISA和流式细胞术，DSS小鼠结肠和脾中IFN-γ、IL-4、IL-17A、IL-10升高，T-bet、GATA3、RORγt上调，Foxp3下调；流式显示Th1、Th2、Th17增加，Treg减少，尤其Th17/Treg轴失衡。IL-10升高不一定仅反映Treg活性。
3. miR-21促进Th17细胞分化并抑制Treg细胞分化。通过体外极化，miR-21在分化第4–6天上调，Th17最高；miR-21抑制剂增加Th1和Treg、降低Th2和Th17；miR-21 mimics增加Th2和Th17、抑制Th1和Treg。表明miR-21调节多个CD4⁺ T细胞分化程序，对Th17/Treg尤为明显。
4. Smad7和Ski是miR-21调控Th17/Treg平衡的直接靶点。通过数据库筛选875个高概率和219个极高概率靶基因，聚焦TGF-β（transforming growth factor-β，转化生长因子-β）通路和T细胞分化，发现Smad7和Ski为负调节因子；DSS结肠中其mRNA降低；TargetScan和双荧光素酶证实miR-21直接结合Smad7和Ski的3′ UTR。Rescue实验中，miR-21抑制剂降低Th17、增加Treg；敲低Smad7或Ski模拟miR-21过表达；共转染逆转抑制剂的效应；双敲低无叠加。SB431542消除miR-21 mimics对Th17/Treg的影响。
5. miR-21通过靶向Smad7和Ski激活p-Smad2/3信号。Western blot显示DSS结肠LPLs中Smad7和Ski蛋白降低、磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）升高；miR-21 antagomir恢复Smad7/Ski、降低p-Smad2/3并减少Th17。IHC显示活动期IBD组织中Smad7/Ski降低，p-Smad2/3和RORγt⁺细胞增加，初步支持该轴。
6. 靶向miR-21干预通过调节Th17/Treg分化缓解DSS诱导急性结肠炎。DSS处理3天后，第4–9天腹腔注射miR-21 antagomir。干预组体重下降、便血、DAI、结肠缩短和组织学损伤减轻，结肠及LPLs中miR-21降低；流式显示LPLs中Th1、Th2、Th17降低，Treg增加；qPCR显示T-bet、GATA3、RORγt及IFN-γ、IL-4、IL-17A、IL-10下调，Foxp3上调；相关分析支持miR-21与这些指标相关；IHC显示RORγt⁺细胞浸润减少。

四、讨论与结论
讨论指出，miR-21在IBD和DSS结肠炎中升高，与炎症严重度和CD4⁺ T细胞稳态破坏相关。该研究并非首次提出miR-21参与T细胞分化，而是扩展既有认识，鉴定Ski为额外功能靶点。Smad7和Ski通过不同但互补机制抑制TGF-β信号：Smad7抑制受体介导的Smad2/3磷酸化，Ski作为转录共抑制因子抑制TGF-β反应基因转录；miR-21同时抑制二者，增强Smad2/3激活，促进Th17/Treg失衡。药理抑制miR-21可恢复Smad7/Ski、降低Smad2/3激活并改善实验性结肠炎。讨论还提到Thorlacius-Ussing et al.报道miR-21定位在UC结肠黏膜CD68⁺巨噬细胞和CD3⁺ T细胞；Rossi et al.、Murugaiyan et al.等既往研究支持miR-21调控Th17。DSS模型Treg减少与部分临床研究不同，原文认为可能归因于急性DSS模型与慢性人类IBD的病理特征差异。局限性包括临床样本量小，Smad7与Ski层级关系不清，未完成3′ UTR突变构建的过表达rescue，机制主要在脾naive CD4⁺ T细胞而非肠LPLs，急性DSS模型更接近UC而非CD，miR-21上游和组织特异性表达待研究。结论翻译：总之，本研究通过鉴定Ski作为除Smad7之外的另一个功能性靶点，扩展了当前对肠道炎症中miR-21生物学的理解。Smad7和Ski的协同抑制增强TGF-β/Smad2/3信号，并促进实验性结肠炎中的Th17/Treg失调。这些发现为理解miR-21在肠道炎症中的多靶点效应提供了更广泛的框架，并支持进一步研究靶向miR-21的UC策略。