《Molecular Therapy Nucleic Acids》：cGAS-mediated immunogenicity impairs the stability and safety of LNP-encapsulated DNA in vivo
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基于DNA的非病毒基因治疗为可滴定增益功能治疗提供了一个有前景的平台，可实现多次给药和持续疗效。然而，其临床转化一直受到非预期免疫激活的限制。研究人员系统研究了小鼠模型中DNA药物诱导毒性的发病机制，重点关注先天免疫反应的贡献。静脉注射脂质纳米颗粒（LNP）-
基于DNA的非病毒基因治疗为可滴定增益功能治疗提供了一个有前景的平台，可实现多次给药和持续疗效。然而，其临床转化一直受到非预期免疫激活的限制。研究人员系统研究了小鼠模型中DNA药物诱导毒性的发病机制，重点关注先天免疫反应的贡献。静脉注射脂质纳米颗粒（LNP）-DNA可诱导全身毒性，其特征为体重减轻、肝损伤和细胞因子风暴。机制上，环状GMP-AMP合酶（cGAS）作为LNP递送DNA的主要传感器，激活两条主要下游通路：I型干扰素信号通路和炎症反应。干扰素反应部分促成整体毒性并抑制转基因表达。对DNA药物稳定性的抑制作用由干扰素诱导的核酸外切酶三引物修复外切酶1（TREX1）介导，该酶主动降解DNA治疗药物并降低其生物利用度。与此同时，炎症激活构成不良反应的另一主要来源，其中TNF-α是肝损伤的关键介质。重要的是，研究人员证明，用地塞米松或Janus激酶（JAK）抑制剂进行预防性免疫调节可减轻LNP-DNA诱导的毒性。多靶点药物地塞米松对不良反应表现出显著更强的抑制作用。该研究结果揭示了控制LNP-DNA制剂安全性和稳定性的核心先天免疫机制，并强调了免疫调节策略对于释放DNA基因治疗潜力的必要性。
论文解读
一、研究背景与科学问题
基因治疗通过递送外源遗传信息实现治疗性功能增益。与病毒载体相比，非病毒核酸递送具有货物设计灵活、载量高、制造可规模化及可重复给药等优势。质粒DNA因其支持相对持久的转基因表达、可容纳启动子等调控元件、制造和储存性质优良，在需要持续蛋白生产的应用中尤为具有吸引力。脂质纳米颗粒（LNP）为体外和体内递送质粒DNA提供了高效手段。然而，系统性LNP-DNA给药可引发显著的先天免疫激活、肝毒性和转基因表达丧失，从而限制了其治疗潜力。
LNP-DNA的不良反应可能源于两个生物学上截然不同的组分：LNP载体和DNA货物。LNP并非免疫惰性，可电离脂质能激活先天免疫通路，内涵体逃逸过程中的膜扰动本身也可诱导炎症信号。而DNA货物在胞内释放后呈现独特的免疫学挑战：质粒DNA一旦进入胞质，即可被宿主为检测外源或错位DNA而进化的DNA感知通路所识别。因此，降低LNP相关反应原性并不一定能消除针对治疗性DNA本身的免疫反应。这一区分对于界定系统性DNA递送安全性限制的机制尤为重要。
在胞质DNA传感器中，cGAS直接识别双链DNA并生成环状GMP-AMP（cGAMP），进而激活STING及下游I型干扰素（IFN-I）和炎症信号。由于cGAS识别基本不依赖序列，治疗性质粒DNA可能激活与检测微生物DNA相同的监视机制。这为DNA治疗药物带来了固有挑战：胞质递送是有效转基因表达所必需的，但胞质DNA暴露同时使先天免疫识别成为可能。另一个胞质DNA传感器AIM2也可能对治疗性DNA产生反应，但其在系统性LNP-DNA反应中的相对贡献尚未完全明确。
DNA感知还可能通过诱导急性炎症之外的方式影响治疗效果。cGAS-STING通路激活IFN-I程序，该程序本质上旨在限制外源核酸的持续存在，可能促进治疗性DNA的清除并缩短转基因表达持续时间。TREX1作为主要胞质DNA核酸外切酶，通过降解异常胞质DNA维持DNA稳态并限制DNA驱动的免疫激活。治疗性DNA的先天识别是否会启动此类DNA清除机制以调节其持续性，同时促成毒性，目前仍不清楚。这提出了DNA药物开发的核心问题：宿主DNA监视如何协调外源DNA的稳定性、治疗活性与安全性？
二、研究内容与主要结论
研究人员系统研究了LNP-DNA诱导不良反应的先天免疫机制。通过比较载体相关与货物相关反应，并遗传性破坏主要DNA感知及下游免疫通路，确定了cGAS是LNP递送DNA的主要传感器。进一步研究表明，cGAS-I型干扰素-TREX1轴促进治疗性DNA清除并限制转基因表达，而炎症信号独立地促成全身性和肝脏毒性。药理抑制这些反应可显著改善LNP-DNA耐受性。这些发现确立了胞质DNA感知作为DNA治疗药物持续性、疗效和安全性之间的核心机制联系。
三、关键技术方法
研究人员使用了多种基因敲除（KO）小鼠模型，包括Cgas?/?、Aim2?/?、Ifnar1?/?、Trex1?/?、Myd88?/?、Tnf?/?、Il6?/?和Casp1?/?小鼠，其中Cgas KO小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，Casp1 KO小鼠购自赛业（苏州），Il6和Tnf-α KO小鼠购自百奥赛图（北京），Aim2 KO小鼠由山东大学齐晓朋教授惠赠，Ifnar1和Trex1 KO小鼠通过Cas9/sgRNA电穿孔受精卵方法自行构建，Myd88 KO小鼠通过sgRNA克隆至px330质粒后显微注射受精卵构建。采用基于DLin-MC3-DMA（MC3）的LNP通过微流控芯片制备包封萤火虫荧光素酶质粒DNA（p-Fluc）的制剂，经尾静脉注射给药。研究运用了活体生物发光成像监测转基因表达、ELISA检测血清细胞因子、生化试剂盒检测ALT/AST、qPCR检测干扰素刺激基因（ISG）表达及质粒DNA拷贝数、免疫印迹检测蛋白表达、油红O染色评估肝脏脂肪变性、组织学检查评估肝损伤等关键技术手段。
四、研究结果
LNP-DNA递送在小鼠中诱导转基因表达和急性毒性。 C57BL/6小鼠静脉注射LNP-DNA（2 mg/kg）后，荧光素酶活性在给药后1天内出现，持续不足3周，第21天显著下降。该晚期下降在Rag1?/?小鼠中被消除，表明针对外源转基因的适应性免疫启动。LNP-DNA制剂诱导三种主要不良反应：显著体重下降（11%–14%）、肝毒性和全身性炎症。细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）产生在3小时达到峰值，ISG上调从3小时持续至1天，ALT/AST升高在1天达到峰值并于7天恢复。组织学检查证实肝损伤，显示严重大泡性脂肪变性，于14天消退。空LNP也能诱导Cxcl10表达，但效应较LNP-DNA弱或更短暂。
cGAS是治疗性DNA的主要传感器。 Cgas缺陷使转基因表达提高3倍以上，体重下降减少55.9%，ALT/AST水平显著改善，炎性细胞因子产生几乎完全消除，IFN-I信号激活显著减弱，凋亡和大泡性脂肪变性显著减少。相比之下，Aim2缺陷仅显著降低IL-1β水平，但不影响转基因表达、体重下降、TNF-α和IL-6产生或肝损伤。因此，cGAS是识别LNP递送DNA并触发下游反应（包括抑制转基因表达和诱导毒性）的主要传感器，而AIM2炎症小体通路贡献有限。
IFN-I信号调控LNP-DNA的转基因表达和毒性。 Ifnar1缺陷使转基因表达提高2–4倍，体重下降减少28.8%，ALT/AST显著降低，肝组织病理改善，TNF-α和IL-6分别降至对照值的约50%和45%，但不影响IL-1β水平。IFN-I信号是cGAS驱动反应的关键但非完全介质，毒性未完全挽救提示存在其他cGAS效应通路。
核酸外切酶TREX1抑制LNP-DNA驱动的转基因表达。 LNP-DNA给药在3小时即诱导肝脏TREX1显著上调，该上调在Cgas和Ifnar1缺陷小鼠中基本消除，确认其依赖cGAS-IFN轴。Trex1缺陷不影响第1天的初始转基因表达，但在第1–8周显著增强表达，并伴随肝内DNA滞留增加。Trex1?/?小鼠表现出加重的体重下降、加速的肝损伤和显著升高的ALT、AST及TNF-α水平。给药后2天内，Trex1?/?小鼠死亡率达38.7%（12/31），对照组为0%（0/24），长期生存率显著降低。TREX1发挥双重作用：限制治疗性DNA持续存在和转基因表达，但其缺失加剧免疫病理。
MyD88介导独立于IFN-I信号的炎症毒性。 Myd88缺陷损害LNP-DNA诱导的下游细胞因子产生，体重下降减少36.5%，ALT/AST水平显著降低，肝脏脂肪变性减弱，但不影响LNP-DNA荧光信号强度。进一步分析显示，Tnf、Il6或Casp1缺陷均不影响转基因表达水平。Tnf缺陷显著降低ALT/AST水平；Il6缺陷反而加剧转氨酶升高；IL-1β不参与LNP-DNA诱导的肝损伤。任何单一细胞因子缺失均不能挽救体重下降，提示MyD88依赖性体重下降存在功能冗余或其他下游效应因子。TNF-α介导肝损伤，而IL-6可能具有肝脏保护作用。
免疫抑制预处理减轻LNP-DNA毒性。 地塞米松预处理显著减少体重下降、肝损伤（ALT/AST和肝脏脂肪变性）和关键促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）产生，同时在第1天增强转基因表达水平。JAK抑制剂芦可替尼预处理有效减轻毒性反应，包括体重下降、肝损伤、炎症反应和肝脏脂肪变性，但未能增强转基因表达水平，可能因为JAK1抑制不仅阻断IFN-I信号，还干扰其他对转基因表达许可性的JAK-STAT通路。
五、讨论与结论
该研究确定了cGAS作为LNP-DNA的主要传感器，并解析了其下游功能轴。cGAS介导的胞质DNA感知是LNP-DNA平台的保守特征，在MC3和ALC-0315制剂中均得到验证。IFN-I信号促成LNP-DNA的不良反应，鉴于蛋白替代疗法需要持续DNA存在，长期给药可能诱导类似I型干扰素病的病理表现。TREX1作为cGAS-IFN轴的负反馈调节因子，通过降解LNP递送的DNA限制转基因表达的持续时间和水平。研究还确定了独立于IFN反应的、由MyD88介导的平行通路，负责全身代谢紊乱、肝毒性和炎症。从转化角度看，用地塞米松等广谱糖皮质激素或JAK抑制剂进行预防性免疫调节可减轻LNP-DNA毒性，其中多靶点药物地塞米松效果更优，不仅能减轻毒性还能增强初始转基因表达。该研究剂量（2 mg/kg）换算人体等效剂量约0.16 mg/kg，与LNP-DNA治疗药物Reqorsa的0.12 mg/kg RP2D相当，提示观察到的先天免疫反应并非过量给药的人工产物，而是与临床可转化剂量水平相关。未来方向包括开发更有效的cGAS/STING抑制剂、DNA的免疫逃逸核苷酸化学修饰，以及设计避免cGAS识别双链DNA的递送系统。
