藜麦壳皂苷抗蜡状芽孢杆菌的构效关系、抗菌机制及其在米饭中的应用研究

《Current Research in Food Science》：Structure-activity relationship and antibacterial mechanism of saponins from quinoa husks against Bacillus cereus and their application in rice

　　

蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种主要的食源性病原体，也是持续存在的食品安全隐患。尽管植物皂苷是有前景的天然抗菌剂，但藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）壳皂苷对蜡状芽孢杆菌的抗菌活性仍鲜有研究。本研究探讨了藜麦壳皂苷对蜡状芽孢杆菌的构效关系与抗菌机制，并评估了其在米饭保鲜中的应用潜力。本研究中，在12种受试皂苷中，低极性皂苷比高极性皂苷对蜡状芽孢杆菌表现出更强的抗菌活性。其中，首次从藜麦壳中分离得到的美洲商陆酸（phytolaccagenic acid, Q8）表现出最强的抗菌活性，其最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）和最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）分别为125 μg/mL和1000 μg/mL。Q8对GES-1细胞表现出低细胞毒性，并能有效抑制米饭中蜡状芽孢杆菌的增殖和腐败。进一步的分析表明，Q8破坏了膜稳定性，导致膜电位耗散、蛋白质泄漏、细胞变形和活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累。代谢组学和脂质组学分析显示，Q8主要影响谷胱甘肽代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、脂肪酸降解以及甘油磷脂/甘油脂代谢。分子对接、RT-qPCR、CRISPR-Cas9基因敲除和遗传互补分析证实，角鲨烯-环羟烯酶（squalene-hopene cyclase, SHC）对藜芦烷类（hopanoid）生物合成至关重要，而藜芦烷类可保护蜡状芽孢杆菌免受Q8诱导的膜损伤。这些发现支持藜麦皂苷作为天然抗菌剂在食品体系中的应用潜力。

藜麦壳皂苷作为一种丰富的低成本和可持续的天然抗菌剂来源，近年来受到了食品科学领域的广泛关注。食品安全是全球重大的公共卫生问题，微生物污染对人类的健康和食品行业构成了持续的挑战。蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种普遍存在的革兰氏阳性食源性病原体，常污染富含淀粉的农产品，尤其是大米和谷物。熟米饭的不当储存会促进蜡状芽孢杆菌的增殖和毒素产生，可能引起以呕吐为主要症状的食物中毒，即常被称作“炒饭综合征”的疾病。此外，抗生素和消毒剂等抗菌剂的过度使用加速了耐多药蜡状芽孢杆菌菌株的出现。虽然合成防腐剂被广泛用于延长食品货架期，但其长期使用会引发细菌应激反应，导致适应性耐受和交叉耐药性。与之相比，天然防腐剂因其多靶点机制和广谱生物活性，不仅降低了耐药性发展的风险，还带来了额外的健康益处。因此，寻找天然、安全、有效的抗菌替代品以增强食品安全已成为关键问题。在众多天然防腐剂中，植物皂苷是第二大类的次生代谢产物，因其结构多样性和多重生物活性而备受关注。研究人员此前发现人参皂苷能有效抑制食源性病原体，但其高成本限制了在食品工业中的实际应用。相比之下，藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）的外种皮富含三萜皂苷，传统上被视为加工过程中的抗营养副产物，这为皂苷提供了充足、低成本且可持续的来源。粗藜麦皂苷已被广泛证明具有抗氧化、抗炎和免疫调节活性，并兼具良好的生物相容性，同时对多种食源性病原体表现出广谱抑制效果。然而，目前的研究主要集中在粗皂苷的生物活性上，关于藜麦皂苷单体的特异性抗菌效果及其潜在机制仍未深入探索。

植物皂苷作为天然两亲性分子，具有典型的表面活性剂特性。在真核生物中，这些生物活性化合物通过插入脂质双分子层与甾醇结合，组装成跨膜孔道，最终导致不可逆的膜破裂和细胞死亡。然而，细菌细胞膜天然缺乏甾醇。相反，许多细菌合成藜芦烷类，这是一类作为甾醇结构和功能类似物的五环三萜脂质。这些脂质成分对于调节膜流动性、维持脂质双分子层结构完整性以及赋予细胞抵抗多种环境胁迫的能力是不可或缺的。尽管藜芦烷类在细菌包膜中具有重要作用，但天然皂苷是否能特异性靶向这些甾醇类似物仍不清楚。特别是在蜡状芽孢杆菌中，藜芦烷类是否参与皂苷引起的膜不稳定性尚未得到系统研究。

因此，本研究旨在探讨藜麦皂苷的构效关系，评估其对蜡状芽孢杆菌的抗菌活性和潜在机制，并评估其作为食品防腐剂的应用潜力。为了全面阐明Q8对蜡状芽孢杆菌的抗菌机制，研究人员首次将非靶向代谢组学、脂质组学、分子对接和基因敲除相结合。在结构鉴定方面，从藜麦壳中分离并表征了8种皂苷单体（Q1-Q8）。其中，Q7被鉴定为3-O-β-D-阿拉伯糖-美洲商陆酸，而Q8被鉴定为美洲商陆酸，这是首次从藜麦壳中分离得到该化合物。在抗菌活性筛选中，只有Q7和Q8表现出抗菌活性，且Q8的抑制作用强于Q7，MIC和MBC值分别为125.00和1000.00 μg/mL。构效关系分析表明，去糖基化导致的极性降低和疏水性三萜苷元骨架的暴露可能增强其与细菌膜的相互作用，这一极性-活性趋势与人参皂苷中的观察结果一致。

为探究作用靶点，研究人员利用原生质体实验，发现去除细胞壁后Q8的抗菌活性没有显著变化，表明肽聚糖细胞壁不是Q8的主要靶点。进一步的SYTO 9/PI染色表明Q8破坏了细胞膜的选择性通透性。通过GES-1细胞毒性实验，Q8表现出低细胞毒性和良好生物相容性。在米饭模型中，Q8显著延缓了蜡状芽孢杆菌引起的变黄和可见腐败，并将第4天细菌数从11.4 lg CFU/g降至9.2 lg CFU/g。研究人员还考察了Q8对细胞膜完整性的破坏作用：Q8诱导剂量依赖性的膜去极化；SYTOX Green摄取增加表明膜通透性升高；细胞外蛋白浓度显著上升证实胞内蛋白发生渗漏；透射电镜观察到细胞变形、包膜破裂和胞质泄漏；此外，Q8还引起细胞活性氧积累增加。

代谢组学分析鉴定出98种显著改变的代谢物，主要涉及谷胱甘肽代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢以及脂肪酸降解途径。脂质组学分析鉴定出22种显著改变的脂质，主要涉及甘油磷脂代谢、甘油脂代谢和不饱和脂肪酸生物合成，提示膜脂组成的广泛重塑。基于脂质代谢的观察结果，研究进一步探讨Q8对膜稳定组分的影响。分子对接结果显示，Q8与角鲨烯-环羟烯酶（SHC）的结合亲和力强于Q7，结合能分别为-8.51和-6.19 kcal/mol。RT-qPCR显示Q8使shc表达下降低1.89倍和2.81倍。通过CRISPR-Cas9基因敲除构建了shc基因缺失突变株，在Δshc突变体中未能检测到藜芦烷类物质，而野生型菌株中存在这些物质。互补菌株B. cereus Δshc-pJOEshc恢复了藜芦烷类生产，证实shc参与了蜡状芽孢杆菌中藜芦烷类的生物合成。Δshc突变体对Q8的敏感性显著升高，MIC降至62.50 μg/mL，MBC降至500.00 μg/mL，抑菌圈从1.07 cm增至1.57 cm，而互补菌株恢复到与野生型相当的水平。进一步分析显示，Δshc突变体在62.50 μg/mL下即表现出显著的膜完整性丧失，膜去极化达到8756.33 a.u.，膜通透性增加（2.77 a.u.），蛋白泄漏增加（6.37 mg/mL），细胞结构严重受损并伴随高水平ROS积累。这些结果表明，SHC衍生的藜芦烷类是维持蜡状芽孢杆菌膜稳定性的重要脂质，其缺失增加了膜对Q8的敏感性，从而增强了Q8的抗菌效果。

研究结论部分指出，藜麦壳作为常规废弃物，含有丰富多样的皂苷，提供了充足、低成本且可持续的皂苷来源。在针对蜡状芽孢杆菌的12种皂苷活性评估中，低极性皂苷显示出比高极性皂苷更强的抗菌效应。首次从藜麦壳中分离得到的美洲商陆酸（Q8）显示出强抗菌活性、对GES-1细胞的低细胞毒性，并能有效抑制即食米饭模型中蜡状芽孢杆菌的增殖和腐败。Q8的抗菌作用涉及膜破坏、胞内ROS积累、以及通过shc转录抑制和与SHC的相互作用干扰藜芦烷类生物合成，从而削弱了藜芦烷类介导的膜稳定化并增加了细菌对氧化损伤的敏感性。这些发现为藜麦皂苷对蜡状芽孢杆菌的构效关系和多靶点抗菌机制提供了新的见解。未来研究应将其防腐性能与食品级防腐剂（如Nisin）进行比较，并验证其对多种蜡状芽孢杆菌分离株及其他食源性或腐败微生物的活性，同时系统评估其热稳定性、体内安全性、感官特性和对米饭及其他食品基质质地的影响。