《eBioMedicine》：Single-cell study of human ovarian response to phthalate exposure reveals glial cell susceptibility and disruption of adhesion and mitochondrial pathways
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背景：邻苯二甲酸酯（phthalates）是已知男性内分泌干扰物与生殖毒物的代表。尽管女性不良生殖结局证据增加，但关键生殖器官中人卵巢层面的机制仍有限，阻碍监管。研究人员以DEHP（di(2-ethylhexyl) phthalate）主要代谢物MEHP（mo
背景：邻苯二甲酸酯（phthalates）是已知男性内分泌干扰物与生殖毒物的代表。尽管女性不良生殖结局证据增加，但关键生殖器官中人卵巢层面的机制仍有限，阻碍监管。研究人员以DEHP（di(2-ethylhexyl) phthalate）主要代谢物MEHP（mono(2-ethylhexyl) phthalate）为对象，用成人人类卵巢组织外植体在单细胞分辨率下绘图其影响。方法：来自7名供体（5名性别肯定手术、2名剖宫产）的卵巢皮质外植体暴露于流行病学相关20.51 nM（1X）与1000倍20.51 μM（1000X）MEHP共6天；以0.1% DMSO为车辆对照。采用10x Genomics单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析1名供体，免疫荧光/多重免疫组化验证6名供体，原代卵巢细胞做Seahorse线粒体应激，干细胞衍生成年施万细胞（Schwann cells）做RT-qPCR验证。发现：外植体保留卵母细胞、颗粒细胞、基质细胞、周细胞、内皮、免疫细胞与罕见胶质细胞。MEHP改变所有细胞类型转录组，破坏肌动蛋白细胞骨架、细胞黏附与氧化磷酸化（OXPHOS）。蛋白水平确认EIF5A、MT-ND3、MT-ND4L与VCL表达改变，涉及线粒体翻译、OXPHOS、黏附与细胞骨架。细胞间通讯减少，尤其胶质-基质互作；原代细胞线粒体应激显示质子漏（proton leak）增加；施万细胞反应与scRNA-seq一致。解释：传统卵巢毒理聚焦卵泡，本研究显示非卵泡细胞易感性，卵巢神经系统细胞对MEHP敏感，为邻苯二甲酸酯、卵巢敏感性指数改变与多囊内分泌代谢卵巢综合征联系提供新机制，呼吁超越卵泡的整体毒理评估。
研究背景方面，邻苯二甲酸酯作为塑料增塑剂广泛存在于化妆品、食品与环境中，人血清、尿液及卵泡液均可检出。现有DEHP（di(2-ethylhexyl) phthalate）风险评价主要基于雄性生殖终点，而女性生殖毒理机制在人卵巢中尚缺单细胞层面证据。卵巢除卵母细胞（oocyte）外，还含颗粒细胞（granulosa cells）、基质细胞（stromal cells）、周细胞（perivascular cells）、内皮细胞（endothelial cells）、免疫细胞与近年发现的胶质细胞（glial cells）；传统环境化学物毒理几乎只关注卵泡，绝大多数体细胞对暴露的易感性未被刻画。因此研究人员以DEHP主要代谢物MEHP（mono(2-ethylhexyl) phthalate）为对象，利用人卵巢皮质外植体在单细胞分辨率下绘制细胞类型特异性反应，该论文发表于《eBioMedicine》。
关键技术方法方面，样本来自瑞典卡罗林斯卡大学医院7名性别肯定手术与2名剖宫产供体的卵巢皮质；其中1名供体做10x Genomics单细胞RNA测序（scRNA-seq，single-cell RNA sequencing），6名供体做免疫荧光与OPAL多重免疫组化验证，3名供体原代卵巢细胞做Seahorse XF线粒体应激检测，并使用女性人诱导多能干细胞（hiPSC，human induced pluripotent stem cell）分化为施万细胞做RT-qPCR验证。分析上还用了Seurat整合、CellChat细胞间通讯、scMetabolism代谢评分与NicheNet配体-受体推断。
人卵巢外植体保留全部预期细胞类型包括胶质细胞：研究人员将DMSO、1X与1000X MEHP三组文库整合，依据经典标志基因与Human Protein Atlas注释出卵母细胞、颗粒细胞、基质细胞、周细胞、内皮细胞、免疫细胞与胶质细胞七大群；胶质细胞高表达MPZ、SOX10、S100B并富集轴突发发生与胶质生成等神经相关本体，证明外植体培养6天后仍保留罕见卵巢神经系细胞。
MEHP改变卵巢细胞转录组：各组细胞比例相近，但所有细胞类型均出现差异表达基因（DEG，differentially expressed gene）。1000X诱导DEG多于1X，而胶质细胞在1X已表现明显反应。按倍数变化看，胶质、免疫与卵母细胞等稀有类型变化最大。GO富集显示细胞黏附、肌动蛋白丝组织、OXPHOS在多种细胞中受影响；scMetabolism显示基质、周管、内皮、颗粒与免疫细胞OXPHOS评分升高。
MEHP对OXPHOS与细胞黏附蛋白的验证：研究人员选MT-ND3、MT-ND4L、EIF5A与VCL做独立队列免疫荧光。MT-ND3与MT-ND4L在血管和免疫细胞下调，在胶质细胞上调，MT-ND3在卵母细胞上调；VCL在卵泡细胞、卵母细胞与血管细胞下调，EIF5A在血管、卵泡与卵母细胞下调。原代卵巢细胞Seahorse显示质子漏随1X、10X、100X、1000X浓度依赖性上升，最大呼吸能力下降，说明MEHP扰动线粒体内膜偶联效率。
MEHP以浓度依赖方式降低细胞间信号：CellChat显示总互作数与强度随MEHP下降；胶质细胞入向信号约降六倍、出向降二至三倍。对照组最强互作见于胶质-基质-颗粒-内皮网络，MEHP后胶质-基质通讯明显削弱，胶原、层粘连蛋白、THBS、FN1、JAM、CADM与NRXN等细胞外基质（ECM，extracellular matrix）和黏附通路下调，SEMA3、PTN、FGF等应激重塑通路相对上调。hiPSC施万细胞模型中PLP、S100、GFAP上调，FBLN2、CACNA2D1等方向与卵巢胶质scRNA-seq一致；NicheNet提示颗粒细胞DCN上调、基质SPON1/LAMB1/DLK1/COL5A1下调，反映ECM与TGF-β样旁分泌微环境被破坏，1000X下胶质AHR（aryl hydrocarbon receptor）下调。
讨论部分总结：研究人员指出，MEHP在人相关浓度即可影响成人卵巢，不只卵泡，非卵泡体细胞尤其是胶质细胞是化学干扰的重要靶标。质子漏增加代表线粒体膜电位耗散的早期应激；既往2D批量测序提出的细胞骨架与黏附连接假说在3D外植体单细胞层面被证实并扩展至OXPHOS。卵巢神经系细胞易感性可解释邻苯二甲酸酯与卵巢敏感性指数下降、多囊卵巢样表型的流行病学关联，意味着化学安全测试不能只用卵泡终点。
研究结论部分原文翻译：卵巢毒理研究传统上聚焦卵泡，但本研究揭示了非卵泡细胞的易感性。重要的是，卵巢神经系统细胞对MEHP的敏感性，为所报道的邻苯二甲酸酯、卵巢敏感性指数（ovarian sensitivity index）改变与多囊内分泌代谢卵巢综合征之间的联系提供了新机制见解。研究结果强调，需要对卵巢毒性进行整体评估，将全部卵巢细胞类型而不仅是卵泡纳入考虑。
综上，该研究把人卵巢毒理从卵泡中心范式推进到全细胞类型单细胞范式，为环境内分泌干扰物的女性生殖风险评估提供了机制依据与监管启示。
